Чем можно стирать мембрану: Как стирать мембрану? | АЛЬПИНДУСТРИЯ

Как стирать мембрану? | АЛЬПИНДУСТРИЯ

Как стирать мембрану? Можно ли гладить мембрану? Правда ли, что порошок забивает поры этого материала, и он теряет свои свойства? Производители утверждают: ухаживать за мембранными тканями очень просто и не надо верить предрассудкам.

Мы обратились за инструкциями по уходу к крупнейшему производителю мембран — Gore-Tex.

Можно ли стирать мембрану?

Стирать мембрану можно и нужно, заявляют производители. Правильный уход не только не навредит материалу, но и продлит срок его службы.

Главные опасения при стирке связаны с риском повредить долговременное водоотталкивающее покрытие (DWR — durable water-repellent) и загубить дышащие свойства мембранной одежды. Тем не менее, как ни странно это звучит, основные рекомендации по уходу связаны вовсе не с сохранением мембраны, а с бережным отношением к остальным, «обычным» тканям в составе одежды и стремлением продлить срок и качество их службы. Мембране, как заверяют производители, ничего не страшно. Технологии!

Как стирать мембрану?

Итак, вы собрались стирать верхнюю одежду с Gore-Tex, Widstopper или другой мембраной. Вот простая пошаговая инструкция:

  • Проверьте карманы. Застегните все молнии, клапаны и ремешки.
  • Стирайте мембрану в стиральной машине при температуре не выше 40º C.
  • Используйте небольшое количество любого жидкого средства для стирки. Подойдут в том числе недорогие жидкие порошки отечественного производства, только проверьте их состав. Мембрану не рекомендуется стирать продуктами, которые содержат кондиционеры, отбеливатели, средства для выведения пятен и хлор.
  • Обязательно прополощите одежду дважды, чтобы удалить остатки моющего средства.
  • Производители рекомендуют стирать мембрану отдельно от сильно загрязненных вещей и не сдавать в химчистку. Если химчистка необходима, обязательно попросите сотрудников использовать для полоскания (лучше записать) бесцветный дистиллированный углеводородный растворитель. А после химчистки необходимо нанести на внешнюю поверхность изделия специальную пропитку, восстанавливающую DWR.

Как сушить и гладить мембрану?

  • Сушить одежду с мембраной можно на веревке, в расправленном состояние на сушилке или в машинке в теплом бережном режиме.
  • Совет, который пугает большинство обладателей мембранной одежды в нашей стране. Когда ваша вещь высохнет, поместите ее в сушилку еще на 20 минут или прогладьте утюгом через полотенце (невысокая температура, без пара). Эти страшные манипуляции нужны, чтобы восстановить DWR на поверхности изделия. Так что мембрана при определенных условиях не боится даже утюга.
  • Кстати, с помощью утюга можно даже сушить мембрану. Включите режим с отпаривателем, положите между утюгом и курткой полотенце и гладьте одежду, пока она не станет почти сухой. Гладить изделие до полного высыхания не нужно.

Как восстановить водоотталкивающее покрытие на мембранной одежде?

  • Во-первых, надо воспользоваться советами по сушке и глажке изделия.
  • Во-вторых, обзавестись специальной пропиткой и обрабатывать ею верхний слой мембранной одежды.

Как ухаживать за обувью с мембраной?

  • Для начала из обуви следует вытряхнуть всю грязь: песок, щебень и прочий мусор. Вынуть стельку.
  • Внешнюю поверхность обуви следует очищать просто теплой водой (не выше 40º C) с помощью тряпочки или щетки.
  • Сушить обувь следует только естественным способом и избегать нагрева.
  • Для ухода будут полезны специальные пропитки для синтетической и кожаной обувью.

Как ухаживать за перчатками с мембраной?

  • Стирать перчатки следует вручную в теплой воде (не выше 40º C). Если поверхность кожаная, не используйте мыло.
  • Отжимать перчатки лучше, начиная с пальцев. Выкручивать перчатки нельзя.
  • Сушить перчатки можно таким же образом, как и прочие мембранные изделия: утюгом через полотенце, в машинной сушке или естественным способом.
  • Перчаткам также не повредит специальная пропитка.

СМОТРИТЕ В ИНТЕРНЕТ-МАГАЗИНЕ

Мембранная одежда

Пропитки и чистящие средства для одежды

Обувь с мембраной

Пропитки и чистящие средства для обуви

Перчатки с мембраной

Инструкции производителя по уходу за мембраной

Инструкция производителя перекрывает любые общие советы по уходу за мембраной. Если производитель запрещает гладить, значит гладить нельзя. Если просит стирать при температуре 30º C, значит стирать изделие следует именно при такой температуре. Если разрешает сдавать вещь в химчистку, значит это можно делать без напрасных опасений.

Следование инструкции — самый банальный совет. Тем не менее, очень часто мы пренебрегаем им в пользу слухов и непроверенных рекомендаций из интернета.

Сегодня производители с ног до головы комплектуют свои изделия высокими технологиями и не жалеют средств на тесты и испытания. Прочитать ярлык и сохранить инструкцию — лучшее, что вы можете сделать для своей одежды. Качественная outdoor экипировка стоит приличных денег, и уход за ней — простой и действенный способ не только продлить жизнь полюбившимся проверенным вещам, но и не тратить лишних средств на новые.

До встречи в горах!

При написании статьи использованы материалы и изображения с сайтов www.gore-tex.ru и www.windstopper.com.

Вы все еще боитесь стирать мембрану? Тогда эта статья для вас!

27 июня 2013   |   Маргарита Васильева

Советы и инструкции

Друзья, эта статья была опубликована в 2013 году. За это время информация по уходу за мембранами обновилась. ЗДЕСЬ вы найдете самый свежий вариант. Спасибо, что заглянули к нам.

Мембранная одежда удовольствие не самое дешевое, особенно если Ваш выбор остановился на топовых высокотехнологичных моделях. Ах, как хочется, чтобы вещь служила долго и хорошо, но всегда наступает момент, когда её нужно постирать. И тут вас охватывает паника!

До сих пор среди масс бытует мнение, что мембранные вещи стирать нельзя. Видимо корни этого мифа уходят во времена, когда мембранные ткани только появились, и, действительно, технологии тогда были не совершенны, и стирать мембрану было чревато. Но это было давно…

Сейчас мы ответственно заявляем: стирать мембрану можно и даже нужно!

Сейчас технологии достигли того уровня, когда при стирке проклейка швов не отходит и прочее… а вот не стирать мембрану вредно.
Мембрана имеет пористую структуру, и в результате носки наши вещи пачкаются, а это значит, что в поры мембраны попадает грязь и забивает их. В следствии чего, ткань постепенно теряет свои «дышащие» свойства. А ещё людям свойственно потеть, а наш пот достаточно агрессивная среда и соответственно, взаимодействуя с ним, мембрана, постепенно начинает разрушаться.  

Страшно?  А ещё страшнее испортить вещь неправильным уходом. Перейдем к делу.


Чего нельзя делать с мембраной:

  • Мембрану нельзя стирать порошком. Все кристаллические средства для стирки мембране противопоказаны, т.к. просто забьют все поры мембраны, и она перестанет дышать, а вы проклянете продавца, который вас обманул, и мембрана перестала работать.
  • Мембрану нельзя варить. Не стоит стирать мембрану в стиральной машине в режиме выше 40 градусов, вы её просто сварите, все поры склеятся и на этом жизнь куртки закончится. А ещё, если куртка цветная, её окраска тоже не рассчитана на то, что её будут варить, и куртка может стать равномерно бурого цвета.
  • Никакой хлорки. Моющие средства, в состав которых входит хлор и его производные противопоказаны. Молекулы хлора оказывают на мембрану перфорирующее действие, за счет чего она начинает лучше «дышать», ну и, конечно, промокать. Таким образом, снижаются водоотталкивающие защитные свойства мембранной ткани.
  • Мембрану нельзя отжимать. Ну, тут даже комментарии излишни – это же мембрана, чего там отжимать. А вот рьяное выкручивание ткани  до добра не доведет, т.к ускорит разрушение растяжениями и миниразрывами.
  • Мембрану нельзя сушить на батарее. Вроде просто и логично, что батарея слишком горячая, но очень часто такие вещи совершаются на автопилоте.
  • Мембрану нельзя гладить. Опять же, просто расплавите и все.
  • Не использовать ополаскиватели и кондиционеры. Опять же химический состав кондиционеров может не благоприятно повлиять на ткань.

Что же можно и нужно делать с мембраной:

  • Прочитать инструкцию по уходу. Система обозначений ухода проста и едина во всем мире.
  • Стирать при температуре не выше 30-40 градусов.
  • Стирать специальными средствами для стирки мембранных тканей, коих великое множество. И их производитель специально разрабатывал состав пропитки, который меньше всего окажет вреда при стирке вашей дражайшей курточки.
    Если по какой-то причине пропитки нет под рукой, то можно воспользоваться жидким средством для стирки, внимательно изучив состав. Или просто мылом. Также мыло спасает при серьезных пятнах, так как спецсредства в силу деликатности с ними не справляются. Просто постирайте пятно с мылом.
  • Отжимать вручную без скручивания.
  • Сушить без прямого воздействия солнечных лучей и высоких температур.
  • Мембраны время от времени необходимо пропитывать, но об этом в следующем пункте.


Почему мембрану нужно пропитывать? Она же и так защищает от влаги.

Изделия, с использованием мембран, пропитываются в процессе производства специальным защитным составом DWR, который обволакивает нити материала, а дальше «как с гуся вода». Но со временем этот защитный слой вытирается, частично сходит при стирках. У куртки начинает подмокать верхний слой ткани. Это обычно  заметно на плечах, там, где находятся лямки рюкзака. Как следствие, куртка набирает на ткань, воду, а значит вес, за счет того, что вода не скатывается, она охлаждает ткань и ваше тело. И тут же работает психологический фактор, вы видите мокрое пятно на поверхности куртки, и вам кажется, что куртка там промокла насквозь.
Вот тогда и становятся нужны пропитки, восстанавливающие свойства ткани и таким образом продлевающие срок службы одежды.
Пропитка – это жидкость или аэрозоль, с помощью которой восстанавливаются водоотталкивающие свойства туристической и спортивной одежды и экипировки.

Пропитки бывают 2х типов: жидкие и аэрозольные. В первом случае, вещь нужно прополоскать в растворе с пропиткой,  а во втором, - напылить на одежду. Чем пользоваться – дело вкуса.

Как пропитывать?

  • Внимательно прочитайте инструкцию.
  • Перед пропиткой вещь нужно постирать, чтобы устранить все инородные частицы с поверхности.
  • Не переборщите с количеством пропитки, а то вещь может перестать «дышать».

Очень хорошие и  добрые люди придумали для нас - лентяев средства 2 в 1, которые являются средством для очистки мембраны и пропиткой одновременно.  Т.е стирать придется 1 раз, а получаете сразу все.  Использование аэрозолей и жидкостей для пропитки мембраны может привести к незначительному изменению цвета изделия.

Любите свои вещи, и они прослужат Вам долго.


комментарии к статье

Как стирать мембранную одежду - руководство

Мембранная одежда является одним из последних достижений текстильной промышленности. Её особая ткань состоит из синтетических волокон, покрытых тончайшим слоем полимерной плёнки с микроскопическими порами. Уникальные мембраны позволяют поту беспрепятственно и быстро испарятся c поверхности тела, а влаге из окружающей среды практически не проникать внутрь. Это одновременно защищает организм от перегрева и переохлаждения. Единственный минус такой одежды заключается в том, что ей необходима деликатная чистка. Как стирать мембранную одежду так, чтобы она не теряла свой внешний вид и свойства?

Три правила стирки

Далее будут перечислены действия, которые чаще всего становятся причиной повреждения мембранной одежды. Старайтесь избегать этих ошибок во время стирки.

  1. Длительное замачивание. В большинстве случаев мембранная одежда прекрасно отстирывается вручную без предварительного замачивания.
  2. Отжим. После того как стирка завершится, можно отжать изделие. Но при этом очень важно не перекручивать ткань. Для того чтобы не повредить мембраны, используйте впитывающую хлопчатобумажную ткань. Она отлично справляется с лишней влагой.
  3. Стирка в машинке. К сожалению, даже наличие специальных режимов для нежных тканей не позволяет использовать современные стиральные машины для чистки мембранной одежды. У вас есть два варианта: научиться правильно стирать вещи вручную или регулярно сдавать их в химчистку.

Верхняя одежда постоянно загрязняется даже при очень аккуратном ношении, поэтому иногда её нужно стирать несколько раз в сезон. Профессиональная чистка не только стоит дорого, но и изнашивает ткани. Если на вещах нет серьёзных загрязнений, вы легко справитесь со стиркой самостоятельно.

Ручная стирка

Лучше всего проводить стирку мембранной ткани вручную. Так как полимерный слой очень тонкий, даже деликатная машинная стирка может повредить его. По этой же причине категорически запрещается использовать обычный порошок. Его частицы слишком крупные и грубые. Они легко забиваются в поры одежды, тем самым не давая ей «дышать» и снижая её защитные свойства. Тот же эффект производят кондиционеры для белья и отбеливатели.

Можно приготовить домашнее средство для стирки, натерев на терке и разбавив водой обычное хозяйственное мыло.

Выбирая порошок для одежды с мембраной, обращайте внимание на его состав. Средства с хлором и его производными делают микроскопические отверстия в ткани более проницаемыми. Вследствие этого одежда начинает промокать.

Большинство специалистов считают, что следует стирать мембранную одежду простым или жидким хозяйственным мылом. Главное, чтобы в их составе не было хлора. Они мягко очищают ткань и не повреждают мембраны, но не решают проблему их закупорки грязью. В этом случае вам помогут специальные средства. Но учитывайте, что нельзя делать столь глубокую чистку слишком часто. Старайтесь носить одежду аккуратно и не доводить её до такого состояния.

Итак, как проводится стирка вещей из мембранной ткани?

  1. Тщательно рассмотрите вашу одежду. Запомните наиболее загрязнённые участки и вытащите всё из карманов.
  2. Отстегните мех. Если мех не отстёгивается (например, на куртке есть помпоны), поместите его в пластиковый пакет и плотно перевяжите.
  3. Закройте все молнии. При необходимости защитите фурнитуру от возможных повреждений с помощью нескольких слоёв скотча.
  4. Наберите в таз или в ванну прохладную воду (30-40 °C) и разведите в ней моющее средство. Необходимое количество порошка рассчитайте по инструкции на упаковке. Если вы используете хозяйственное мыло, подготовьте мыльный раствор.
  5. Опустите одежду в воду и сразу же приступайте к стирке. Делайте всё быстро, но аккуратно. Не подвергайте одежду механическим воздействиям.
  6. Если вы заметили, что некоторые загрязнения не отходят, воспользуйтесь мягкой щёткой и мыльной пеной.
  7. Прополощите изделие под струёй холодной воды и дайте ей свободно стечь. Теперь вы можете воспользоваться впитывающими салфетками или осторожно отжать его.

Старайтесь стирать только одну вещь зараз. Слишком длинный контакт с водой не пойдёт на пользу мембранам.

Сушка

Постирав вашу одежду из мембраны, обязательно просушите ее.

Мембранная одежда сушится в разложенном виде и горизонтальном положении. Старайтесь делать это в хорошо проветриваемом помещении. Избегайте прямых солнечных лучей и близости батарей. Они могут привести к выгоранию тонкого слоя мембран.

Дополнительный уход и хранение

Чтобы не нарушить особую структуру ткани, не гладьте её. Это не только повреждает мембраны, но и может расплавить синтетический слой куртки. Если без глажки не обойтись, воспользуйтесь парогенератором или отнесите вещь в химчистку.

Для того чтобы улучшить водоотталкивающие свойства мембран и защитить их от загрязнений, обработайте одежду специальным фтористым спреем. Фтор покрывает ткань плёнкой, которая защищает её, но не препятствует обычной циркуляции воздуха. Регулярное применение спреев также помогает вещам пережить негативное воздействие солнечных лучей.

Мембранную одежду хранят в расправленном виде в вертикальном положении. Для того чтобы мембраны не забивались пылью, следует накрыть её защитной плёнкой из ткани или полиэтилена. После окончания сезона одежду из мембранной ткани обязательно нужно постирать, и только после этого убрать в шкаф. Это несложное правило позволяет сохранить вещь в прекрасном виде. Вы сможете достать и сразу же начать носить её при необходимости.

Освойте эти несложные правила, и стирка мембранной ткани перестанет вызывать у вас затруднения, а одежда будет служить долгие годы.

Как стирать мембранную одежду в стиральной машине и сушить ее после стирки?

Потратив приличную сумму на качественную горнолыжную куртку или трекинговый костюм, вы наверняка захотите узнать, как стирать мембранную одежду так, чтобы ее уникальные свойства радовали вас как можно дольше. Насколько легко привести мембрану в негодность? Действительно ли она требует специального деликатного ухода? Как сделать так, чтобы со временем ее водоотталкивающие свойства не ослабились? Ответим на все эти вопросы по порядку.

Не стоит волноваться по поводу стирки

На самом деле вещи из мембраны нового поколения не так просто испортить, как вам может показаться. Да, неубиваемыми их назвать нельзя, но ваш костюм, куртка или штаны могут беспроблемно пережить загрузку в стиральную машину, так и ручную стирку. Но при определенных условиях.

Выбор моющего средства

Долгое время считалось, что капсулы порошка забивают микропоры мембраны, лишая ее одного из важнейших качеств: проводимости пота наружу. Да, водоотталкивающие свойства при этом не нарушаются, но ведь мембранные вещи ценятся за способность «дышать», и начать потеть в дорогущем мембранном костюме было бы очень обидно. Именно поэтому рекомендуется использовать жидкие моющие средства, которые уж точно не останутся в микропорах.

Также чем натуральнее и мягче средство, тем лучше. Конечно, можно использовать специальные моющие средства для мембранных вещей, но ваш горнолыжный костюм отстирается ничуть не хуже любым неагрессивным жидким моющим средством: от капсул для стиральных машин популярных порошковых марок до обычного жидкого мыла. Главное, чтобы средство было без хлора и кондиционера, а также не было предназначено для выведения пятен.

Совет

Если вас раздражает грязное пятно, которое вы заполучили в самом начале сезона, из-за него подвергать вещь стирке совсем не обязательно. Просто удалите подсохшую грязь сухой тряпкой или щеткой! Да, качество очищения будет ниже, но зато не нужно будет проводить длительную стирку, сушку, глажку и обработку по всем канонам.

Стиральная машинка или ручная стирка?

По большому счету, оба способа подходят для того, чтобы стирать мембранные костюмы или куртки, и даже рекомендации по ним одинаковы. Так что можете прибегнуть к любому из них, если будете соблюдать основные правила по стирке.

  • Не стирайте вещи после каждой поездки на горнолыжный спуск: вы замучаетесь каждый раз их сушить и обрабатывать пропиткой. Вместо этого постирайте их только раз после сезона. Мембранная ткань имеет свойство впитывать запахи, и, хотя жалобы на запах пота крайне редки, в этом случае постирать вещь можно дополнительно в середине сезона, но не чаще.
  • Мембрана не переносит высоких температур, поэтому стирка в горячей воде ей противопоказана. Температура воды не должна превышать 40˚С, но лучше обратиться к инструкции за более подробной рекомендацией от производителя. Может, именно вашу горнолыжную куртку или костюм можно стирать только при температуре до 30˚С, да еще и в ручном режиме. Не забывайте о важности информации на бирке!
  • Не стирайте мембранные вещи вместе с другими вещами, особенно если на них много грязи, ведь мембрана впитывает мелкие частички пыли и других загрязнений, которые из глубоких слоев тканевого «сэндвича» уже не достать. Если она сама сильно загрязнена? Советуем сначала смахнуть и стереть максимум грязи сухой тряпкой или щеткой.
  • Мембранной одежде не повредит дополнительное полоскание, особенно если вы все же стирали ее гранулированным порошком. Это касается стирки в стиральной машине, так и стирки вручную.
  • Отжимать мембрану можно только при низких оборотах, а еще лучше просто дать воде стечь без лишнего механического воздействия.

И не забудьте застегнуть все молнии и застежки перед тем, как взяться за стирку!

Совет

Если вы выбрали ручную стирку, то она должна проходить без застирывания и отжимания со скручиванием, иначе гидрофобная пропитка очень быстро сотрется, а другие материалы, используемые помимо мембраны, придут в негодность.

А что насчет сушки, глажки и ухода?

Если не забывать про то, что мембрана не любит высокие температуры, то при сушке и глажке вы вещь точно не испортите. Вы удивитесь, но сушить такие вещи можно даже в машинке или сушилке в самом щадящем режиме. Если же такой вариант вам не подходит, то сушите по старинке.

  • Когда вода стечет, расправьте одежду на горизонтальной сушилке и дайте вещам высохнуть при комнатной температуре.
  • Или же повесьте вещь на вертикальную сушилку и дождитесь ее высыхания также при комнатной температуре.

А вот помощью обогревателя или батареи пользоваться не стоит: они генерируют слишком много тепла, которое в итоге может оказаться губительным для материала.

Глажка при правильной сушке не понадобится, но если решите гладить, то только через прослойку из довольно толстого хлопка. Например, через полотенце.

Ну и не забудьте восстановить гидрофобное покрытие при помощи специальных пропиток: это делать не обязательно, и воду пропускать мембрана все равно не будет, но если вы хотите, чтобы вода эффектно стекала с куртки каплями, а не оставалась на ней, то придется такой пропиткой все же обзавестись.

Уход за мембранной одеждой не так сложен и соблюдая простые рекомендации по стирке, сушке и глажке таких вещей, можно радоваться чистоте костюмов и курток без боязни их испортить.

Как стирать мембранную одежду в стиральной машине или вручную

Хотя вещи из мембранной ткани повседневными назвать нельзя, они часто присутствуют в гардеробе спортсменов и людей, ведущих активный образ жизни. И также нуждаются в чистке. Но стирать мембранную одежду надо с некоторыми ограничениями, чтобы она не утратила своих ветрозащитных и водоотталкивающих свойств.

Выбор моющих средств

Перед тем как подвергнуть мембранную куртку или штаны водным процедурам, в первую очередь, надо определиться с моющими средствами. Чем нельзя стирать и почему:

  • Стиральный порошок. Частички моющего средства в этой форме забиваются в поры мембраны. И выполоскать их оттуда полностью будет почти невозможно (особенно, если стирать вручную). В результате вещь перестанет «дышать».
  • Кондиционер для белья. Придаст приятный запах, но уменьшит гидрофобные свойства материала.
  • Средства, содержащие хлор. Вещество сделает поры мембраны более широкими, что лишит ткань гидрофобных свойств, и вещь начнёт промокать во время дождя или снегопада.
  • Пятновыводители и отбеливатели (в том числе и кислородные). Действуют на структуру мембраны подобно хлору. Кроме того, содержащиеся в них агрессивные вещества истончают ткань, и через короткое время куртка и комбинезон перестанут спасать от ветра и мороза.

Список средств, разрешенных для стирки мембраны, гораздо внушительнее. В него входят: жидкие моющие для стирки мембранной одежды, шампуни для волос, не образующие большого количества пены, гели для душа, стружка хозяйственного или детского мыла, растворенная в воде.

Мыло плохо выполаскивается, поэтому применять его в цельном виде для стирки мембраны не стоит. Лучше всего оно подойдёт для выведения пятен наряду с гелем для мытья посуды и «Антипятином».

Для вещей из мембранной ткани стоит использовать гидрофобные пропитки во время или после стирки. Применять согласно инструкции. Это сохранит влагоотталкивающие свойства материала и создаст защитный слой от загрязнений.

Как стирать в машине

Можно ли выстирать мембранную одежду в стиральной машине, или приемлема лишь ручная обработка? Привести в порядок спортивные вещи данной категории возможно любым способом, если соблюдать правила.

При машинной стирке куртки или штанов с мембраной следует взять на вооружение такие советы:

  • Очистить карманы от мелких вещей и мусора. Застегнуть молнии и кнопки. Рекомендуется вывернуть наизнанку.
  • Стирать мембрану отдельно от других вещей. Барабан должен быть заполнен не более чем на 2/3 объёма. Если изделия объёмные, значит, потребуется отдельная стирка для каждого.
  • На панели выбирать режим «ручная стирка», «шерсть» или «синтетика» с температурой 30-40°С. «Сушку» и «отжим» использовать категорически нельзя. В первом случае синтетические волокна расплавятся, во втором – полотно может быть повреждено вплоть до разрывов.
  • Полоскать одежду следует дважды, добавив в кювет для кондиционера, жидкую пропитку. Если она отсутствует, оставить ёмкость пустой.

Ручная обработка

Если принято решение постирать предмет гардероба из мембраны вручную, следует действовать так:

  1. Подготовить одежду: вычистить мусор из карманов, застегнуть все замки и кнопки. Вывернуть наизнанку.
  2. Ванну на 1/3 заполнить тёплой водой. Растворить в ней моющее средство.
  3. Погрузить одежду в воду, дождаться, пока она напитается водой. Замачивать мембрану надолго не рекомендуется.
  4. Если на поверхности ткани имеются пятна, на них наносят гель для мытья посуды или мыло против пятен. Через 2-3 мин их аккуратно застирывают с помощью мягкой мочалки. Тереть материю руками нельзя, так как интенсивное механическое воздействие повредит её структуру.
  5. После удаления пятен вещь несильно мнут ладонями несколько минут, отодвигают на край ванны, противоположный тому, над которым находится кран, и спускают воду.
  6. Заполнив ванну наполовину тёплой водой, спортивную одежду полощут. Процедуру повторяют несколько раз.
  7. По инструкции при последнем полоскании или после стирки используют водоотталкивающую пропитку.

Даже при сильном загрязнении изделий температура воды не должна превышать 40°. В горячей мембрана не очистится, а спрессуется и потеряет свои свойства, к тому же ткань приобретёт некрасивый, грязно-серый оттенок.

Сушка

Правильно высушить спортивный наряд не менее важно, чем грамотно его постирать. Ведь погубить мембранную одежду можно именно на этом этапе. Как действовать, чтобы этого не случилось?

  1. Чистое изделие, не выкручивая, оставляют в ванной или тазу, чтобы с него стекла основная влага.
  2. Слегка отжав полотно ладонями, вещь заворачивают в байковую пелёнку, махровое полотенце или свёрнутую вдвое простыню.
  3. Когда верхнее полотно станет влажным, его разворачивают и кладут одежду на горизонтальную поверхность, застеленную клеёнкой и сухой материей. Периодически переворачивая, досушивают. Вешать на плечики мокрую куртку нельзя, поскольку она, наверняка, деформируется. Кроме того, запрещается развешивать изделия на горячих батареях или под прямыми солнечными лучами. Жар расплавит полотно, а ультрафиолет оставит на нём светлые пятна.
  4. Если при полоскании не использовалась жидкая пропитка, её распыляют на сухую модель из баллончика.
  5. Гладить изделие с мембраной очень опасно, тем более, после правильной стирки и сушки это не потребуется.

Наносить гидрофобное средство на ткань не обязательно, но желательно, так как фабричное защитное покрытие при стирке из неё вымывается. Грязную вещь обрабатывать бесполезно.

Видео по теме

О стирке пуховой куртки с мембраной.

Таким образом, если не игнорировать правила стирки, мембранная одежда сохранит свои особые свойства на протяжении всего срока службы.

Как стирать мембранную одежду Хиппичик

Чтобы непромокаемая одежда служила дольше и сохраняла свои свойства, ее нужно стирать, учитывая особые потребности мембранных тканей. Уделите внимание правильному уходу и комбинезон прослужит не один сезон.

Стирать мембранные ткани не сложнее, чем обычные. У них другое строение, а потому и другие потребности при уходе. Разобравшись один раз, вы сможете легко ухаживать за технологичными тканями.

Чистые микропоры. Поры мембраны могут забиться не только грязью, но и остатками неподходящих моющих средств. Порошки остаются на ткани после стирки и закупоривают поры мембраны. Используйте моющие средства, разработанные для мембранных тканей. Они не забивают поры и очищают их от уже накопленных загрязнений и остатков других моющих средств.

Бережная стирка. Во время стирки мембрана становится уязвимой. Выжимания, скручивания, энергичное оттирание грязи приводят к микротрещинам и заломам. Моющие средства с хлором, пятновыводители, отбеливатели, ополаскиватели, кондиционеры — содержат вещества, нарушающие структуру ткани. Специальные средства для стирки мембраны бережно отстирывают грязь и без механического воздействия.

Сохранение водоотталкивающего слоя. Производитель пропитывает ткань для комбинезонов Хиппичик специальным водоотталкивающим составом. От времени, активной носки и стирок заводская водоотталкивающая пропитка истончается. А когда верхний слой ткани сильно намокает, мембрана не работает. Чтобы сохранить заводскую пропитку как можно дольше, используйте спец.средство для стирки. Оно мягко очистит ткань от грязи, но сохранит водоотталкивающие свойства. Со временем понадобится и специальная водоотталкивающая пропитка, чтобы восстановить первоначальные водоотталкивающие свойства ткани.

Чем стирать

Нельзя использовать обычные порошки, они забивают мембрану. Средства с хлором и любые отбеливатели разрушают ее структуру. Оптимальный вариант — специальное средство для стирки одежды из мембранной ткани или жидкие средства без хлора.

  • Специальные средства для стирки мембранных тканей: Nikwax Tech Wash , Denkmit Fresh Sensation и другие
  • Средства для очищения спортивной одежды: DOMAL Sport Fein Fashion, Perwoll Sport & Active
  • Хозяйственное мыло подходит для ручной стирки мембранной одежды. А еще его можно использовать для удаления особо въевшихся пятен — слегка потереть старой зубной щеткой.
  • Жидкие (гелеобразные) средства для стирки обычных марок: Ariel, Tide и так далее.
  • Не замачивайте мембранные ткани и не используйте кондиционеры или ополаскиватели.

Как продлить жизнь мембране

       Стирка

  • Стирайте Хиппичик как можно реже
  • Удаляйте грязь влажной тканью, мыльной губкой и/или струей душа
  • Пользуйтесь специальными жидкими средствами для ухода за мембранной одеждой: средством для стирки и средством для пропитки после стирки
  • Перед стиркой застегните все молнии и липучки, удалите сухую грязь щеткой
  • Хотя производитель допускает машинную стирку при 30 градусах, мы советуем стирать Хиппичик вручную без замачивания

          После стирки

  • Не отжимайте и не выкручивайте комбинезон, это приводит к микроразрывам мембраны
  • После стирки выверните комбинезон подкладкой наружу и расправьте
  • Аккуратно подвесьте над ванной или тазом, чтобы стекла вода
  • Обработайте пропиткой для восстановления водоотталкивающий свойств
  • Разложите на полотенце для окончательной сушки

         
Нельзя, это повреждает мембрану 
  • Не сушите мембранную одежду вблизи любых источников тепла: батарей, радиаторов, обогревателей, печек, каминов и так далее. Гладить утюгом тоже нельзя
  • Не пользуйтесь обычными стиральными порошками
  • Не пользуйтесь кондиционерами

Как использовать средство для стирки Nikwax Tech Wash

Nikwax Tech Wash это простое в использовании безопасное биоразлагаемое моющее средство на водной основе. Сохраняет и восстанавливает все дышащие, водонепроницаемые и водоотталкивающие свойства мембраны. Для бережного и тщательного очищения мембраны.

Ручная стирка

Очистите сильно загрязненные места щеткой, хорошо встряхните бутылку, наденьте перчатки. Погрузите одежду в теплую воду (рукам должно быть приятно горячо). Добавьте в воду 1 колпачок моющего средства для мягкой воды, 2 колпачка - для жесткой, перемешайте.
Аккуратно постирайте без скручиваний и выжиманий. Пятна можно слегка потереть мягкой зубной щеткой. Прополощите одежду в чистой воде 3 раза.

Стирка в стиральной машине

Стирка в стиральной машине сокращает срок службы мембраны, но экономит ваше время.
Проверьте, все ли остатки моющих средств удалены из емкостей и положите две вещи в барабан. Налейте средство Nikwax Tech Wash в верхний колпачок от флакона. Для жесткой воды 3 колпачка (всего 150 мл) или 2 при мягкой воде (всего 100 мл). Запустите режим в соответствии с инструкцией на ярлычке: режим «деликатная» или «ручная стирка» при 30 градусах, отключите отжим.
Не добавляйте и не разбавляйте Nikwax Tech Wash обычными стиральными порошками. Не используйте ополаскиватель или кондиционер. Сушите вдали от источников тепла при комнатной температуре.

Как вернуть водоотталкивающие свойства

Заводская водоотталкивающая пропитка внешней поверхности ткани защищает мембрану от намокания снаружи. Постепенно она смывается и водоотталкивающие свойства ткани снижаются. Чтобы мембрана продолжала эффективно выводить пар наружу, обработайте снаружи комбинезон водоотталкивающей пропиткой.
Обработку делайте после стирки. Расправьте комбинезон и равномерно распылите Nikwax TX.Direct Spray-On по внешней поверхности ткани. Оставьте полностью просохнуть.

Я стираю обычным порошком в стиральной машине, это плохо?

Как ухаживаем за вещами, такой результат и получаем. Мембранная непромокаемая одежда оправдает затраты на нее и прослужит дольше при правильном уходе.

Стирка как обычно  Стирка как надо

Обычный стиральный порошок забивает поры мембране. Одежда будет хуже «дышать», ребенок будет в ней больше потеть

Быстрее смывается водоотталкивающая пропитка. Скоро комбинезон начнет быстро промокать

Отжим на больших оборотах повредит мембрану.
Она может треснуть или отслоиться

Специальное средство очищает поры на мембране, сохраняя дышащие свойства одежды

 Спец.средство бережно очищает, сохраняя водоотталкивающий слой

Редкая стирка в ручном режиме без замачивания и отжима продлевает жизнь мембране

Чем стирать мембранную одежду, куртки из мембранной ткани

Особенности одежды из мембранных тканей

Чем стирать мембранную одежду? Найдем сегодня ответ на этот вопрос.


Многие считают, что дорогие вещи из мембранной ткани совсем нельзя стирать. Однако это не так. Если вещи из мембранной ткани испачкались, то при соблюдении правильного режима стирки и выборе подходящих моющих средств их можно стирать.

Что представляет собой мембранная одежда?

Мембранная ткань обычно состоит из синтетической основы и мембранного слоя. Мембрана – это очень тонкая пористая пленка толщиной от нескольких сотых до десятых долей миллиметра.
Такая структура материала выводит пот наружу, позволяя коже дышать.
Мембранная одежда используется в основном для туризма и занятий спортом. Так мембранную одежду часто носят лыжники и альпинисты.

Часто мембранные вещи покупают детям для активных зимних прогулок и спорта.

При покупке мембранной одежды надо иметь в виду, что она достаточно дорогая и нуждается в особом уходе. И даже при правильной стирке или чистке мембранная одежда не слишком долговечна.

Чем нельзя стирать мембранную одежду

При неправильном уходе мембранная одежда теряет свои полезные свойства.


Разберемся сначала, чем и как нельзя стирать мембранную одежду.
Мембранные вещи нельзя стирать:
  • обычным стиральным порошком;
  • средствами с хлоркой;
  • с ополаскивателями и кондиционерами для стирки.

Если постирать мембранную одежду обычным стиральным порошком, она на вид никак не изменится. Однако микроскопические поры на мембране окажутся забитыми образовавшимися при стирке кристаллами. Из-за этого мембранная одежда перестанет выполнять свою главную функцию – вывод влаги на поверхность и обеспечение воздухообмена.


Хлорка, которая входит в состав многих средств для стирки, просто разрушает мембрану.
Различные ополаскиватели также уменьшают водоотталкивающие свойства мембранной одежды.

Еще мембранная одежда не переносит высокой температуры. Поэтому ее нельзя стирать при температуре выше 40 градусов. Также мембранные вещи нельзя гладить и сушить на батареях и обогревателях.


Кроме того, вред мембранной одежде приносит отжим и сушка на открытом солнце. Грубый отжим приводит к разрыву и растяжению мембраны. А от яркого солнца на вещах могут образоваться несмываемые пятна.

Чем можно стирать мембранные вещи

Чем же тогда можно стирать мембранную одежду?


Мембранную одежду можно стирать специализированными средствами для мембранных тканей. Также для стирки подойдут и некоторые домашние средства.
Известные специальные средства для стирки мембранной одежды:
  • Nikwax Tech Wash;
  • Perwoll Sport & Active;
  • DOMAL Sport Fein Fashion;
  • DM Fresh Sensation;
  • Woly Sport Textile Wash.

Для ручной стирки мембранных вещей можно использовать средство для мытья посуды Fairy, гели для душа, шампуни.

Можно стирать мембранную одежду натертым и предварительно растворенным в воде хозяйственным или детским мылом или мыльной стружкой.

Вместо натертого мыла для ручной стирки мембранных тканей подойдет мыльный стиральный порошок Чистаун. Его также надо перед стиркой полностью растворить в воде.
После стирки мембранных вещей мылом или порошком Чистаун надо несколько раз тщательно прополоскать вещи в теплой воде, чтобы остатки мыла не забили поры мембраны.

Как правильно стирать мембранные вещи, чтобы не испортить мембрану

Перед стиркой надо проверить карманы, застегнуть все застежки.


При ручной стирке мембранных вещей их нельзя тереть – мембрана может повредиться.
Как стирать вручную мембранные вещи:
  • налить в тазик теплую воду — до 40 градусов;
  • растворить в воде специальное средство, натертое мыло или стиральный порошок Чистаун;
  • постирать очень деликатно, без трения и выкручивания;
  • слить воду и несколько раз прополоскать до полного вымывания стирального порошка.

Как стирать мембранную одежду в стиральной машине:

  • не наполнять вещами полный барабан стиральной машины;
  • выбрать деликатный режим и температуру 30 градусов;
  • залить гель для машинной стирки;
  • выбрать не меньше трех полосканий;
  • отключить отжим.

Как сушить мембранные вещи после стирки

Сначала надо завернуть вещь в махровое полотенце, чтобы в него впиталась вода. Затем расправить одежду и разложить для сушки в горизонтальном виде.


Сушить одежду лучше в сухом помещении с хорошей вентиляцией.

Даже если правильно стирать мембранную одежду, примерно через 20 стирок она значительно истончится и ее качества ухудшатся. Поэтому надо постараться реже стирать мембранные вещи. И по возможности только очищать свежие пятна. Чтобы вещи из мембранной ткани служили долго, их надо стирать не чаще одного раза в год.

Технологии очистки мембран

Существует несколько различных методов очистки мембран, таких как прямая промывка, обратная промывка и продувка воздухом.

· Когда применяется прямая промывка, мембраны промываются питательной водой или пермеатом вперед. Питающая вода или пермеат протекает через систему быстрее, чем на этапе производства. Из-за более быстрого потока и возникающей в результате турбулентности частицы, абсорбированные мембраной, высвобождаются и выводятся. Частицы, которые впитываются в поры мембраны, не высвобождаются.Эти частицы можно удалить только обратной промывкой.

· Обратная промывка - это обратный процесс фильтрации. Пермеат промывается через сторону питающей воды системы под давлением, применяя вдвое больший поток, чем используется во время фильтрации. Если флюс не восстановился в достаточной степени после обратной промывки, можно применить процесс химической очистки.

· В процессе химической очистки мембраны пропитываются раствором хлорного отбеливателя, соляной кислоты или перекиси водорода.Сначала раствор впитывается в мембраны в течение нескольких минут, а затем применяется прямая или обратная промывка, в результате чего загрязнения вымываются.

· Новым методом очистки является так называемая продувка воздухом или продувка воздухом / водой. Это прямая промывка, во время которой воздух нагнетается в трубу подачи. Поскольку используется воздух (в то время как скорость воды остается прежней), создается гораздо более турбулентная система очистки.

Прямая промывка

Когда прямая промывка применяется в мембране, открывается барьер, который отвечает за управление тупиком.В то же время мембрана временно выполняет фильтрацию с поперечным потоком без образования пермеата.
Целью прямой промывки является удаление образовавшегося слоя загрязнений на мембране за счет создания турбулентности. Во время прямой промывки необходим высокий градиент гидравлического давления.

Обратная промывка

При обратной промывке поры мембраны вымываются наизнанку. Давление на стороне пермеата мембраны выше, чем давление внутри мембраны, что приводит к очистке пор.Обратная промывка выполняется под давлением, примерно в 2,5 раза превышающим производственное давление.
Пермеат всегда используется для обратной промывки, потому что камера пермеата всегда должна быть свободна от заражения. Следствием обратной промывки является снижение восстановления процесса. Из-за этого обратная промывка должна занимать как можно меньше времени. Однако промывка должна поддерживаться достаточно долго, чтобы полностью промыть объем модуля хотя бы один раз.

Промывка воздухом или промывка воздухом / водой

Загрязнения на поверхности мембраны необходимо удалять как можно эффективнее во время обратной промывки.Так называемая продувка воздухом, концепция, разработанная Nuon в сотрудничестве с DHV и X-flow, оказалась очень полезной для выполнения этого процесса. Использование продувки воздухом означает промывку мембран изнутри смесью воздуха и воды.
Во время продувки воздухом к прямой продувке добавляется воздух, в результате чего образуются пузырьки воздуха, вызывающие повышенную турбулентность. Благодаря этой турбулентности загрязнения удаляются с поверхности мембраны.
Преимущество продувки воздухом по сравнению с прямой продувкой состоит в том, что в процессе очистки используется меньшая производительность насоса.

Химическая очистка

Если вышеупомянутые методы очистки недостаточно эффективны для снижения флюса до приемлемого уровня, необходимо очистить мембраны химическим способом.
Во время химической очистки химикаты, такие как хлористый водород (HCl) и азотная кислота (HNO 3 ), или дезинфицирующие средства, такие как перекись водорода (H 2 O 2 ), добавляются в пермеат во время обратной промывки. Как только весь модуль заполнится пермеатом, химикаты должны впитаться.После полного впитывания чистящих химикатов модуль промывается и, наконец, возвращается в производство.

Часто методы очистки комбинируются. Например, можно использовать обратную промывку для удаления загрязнения пор, за которой следует прямая промывка или продувка воздухом.
Используемый метод или стратегия очистки зависит от многих факторов. На практике наиболее подходящие методы определяются методом проб и ошибок (практические испытания).

Удаление биопленки

Химическая очистка

Мембранная технология и опреснение сточных вод

Высокий фон в вестерн-блотах

Вестерн-блоттинг - это мощный метод анализа экспрессии белков.С помощью этого единственного анализа отдельные белки могут быть оценены на предмет молекулярной массы, посттрансляционных модификаций и численности. Вестерн-блоттинг относительно прост в выполнении и не требует дорогостоящего оборудования или реагентов, что делает их основой для многих лабораторий.

Ключом к успешному вестерн-блоттингу является использование антитела, которое специфически реагирует с одним белком и имеет небольшую перекрестную реактивность с другими белками. Успешный блоттинг также зависит от соотношения сигнал / шум, которое позволяет обнаруживать белок с минимальным фоном.Высокий однородный фон и неравномерный фон с пятнами - частые проблемы при вестерн-блоттинге. В этой вики-статье описаны распространенные причины и решения для высокого фона в Вестерн-блотов.

Равномерно высокий фон

Равномерно высокий фон - это фон, который затемняет все пятно, что затрудняет просмотр отдельных полос. Единообразный фон может быть результатом множества причин.

Высокая концентрация антител

Если используются чрезмерно высокие концентрации антител, они могут насыщать и покрывать мембрану, неспецифично связываясь.Это приведет к равномерному высокому фону по всей клякве. При использовании усиленной хемилюминесценции (ECL) иногда блот даже светится в темноте.

Титруйте антитела

Чтобы снизить высокий фон из-за высокой концентрации антител, титруйте антитела. Дот-блот может использоваться для титрования как первичных, так и вторичных антител в виде шахматной доски.

Недостаточное блокирование

Блокирование мембраны - важный шаг, который предотвращает неспецифическое связывание антител с мембраной.Достаточное блокирование достигается инкубацией блота в соответствующем блокирующем буфере. Тип блокирующего агента, продолжительность и температура инкубации могут влиять на эффективность блокирования.

Блокирующие реагенты

Выбор блокирующего реагента зависит от конкретного взаимодействия антиген: антитело и лучше всего определяется эмпирически.

В качестве первого выбора обычно используется обезжиренное сухое молоко. Часто рекомендуется использовать 5% -ное молоко для блокирования, однако иногда такая концентрация молока может маскировать обнаруживаемый белок, особенно если его не так много.Мы рекомендуем начинать с 1% молока.

Молоко может быть несовместимо с некоторыми антителами и системами обнаружения (см. Влияние несовместимых блокирующих агентов), и в этом случае 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) является вторым блокирующим агентом на основе белка, который можно использовать.

Несколько компаний продают безбелковые блокирующие агенты, такие как AdvanBlock-PFby Advansta. Безбелковые агенты предотвращают помехи, но также могут использоваться в сочетании с белковыми агентами для увеличения блокирующей способности.

Продолжительность и температура инкубации

Блокирования в течение 1 часа при комнатной температуре с перемешиванием обычно достаточно для блокирования мембраны. Однако блокирование также можно проводить в течение ночи при 4 ° C с перемешиванием.

Помехи от несовместимых блокирующих агентов

Может наблюдаться однородный высокий фон, когда блокирующие агенты взаимодействуют с антителами, вызывающими помехи. Например, антитела могут связываться с белками в блокирующих средствах на основе белков и приводить к высокому однородному фону.В частности, сыворотка животных, содержащая неочищенные первичные антитела, может связываться с белками животных в блокирующих реагентах. Кроме того, обезжиренное сухое молоко может специфически реагировать с определенными антителами или реагентами для обнаружения. Молоко содержит казеин, фосфопротеин, который может реагировать с фосфоспецифическими антителами. Молоко также содержит различные количества авидина, которые могут мешать работе систем обнаружения авидин-биотина. Оба эти взаимодействия приведут к высокому однородному фону.

Тестируйте разные блокирующие реагенты

Для каждой комбинации антиген: антитело необходимо определить соответствующий блокирующий агент.Как обсуждалось выше, двумя наиболее распространенными блокирующими агентами являются обезжиренное сухое молоко и бычий сывороточный альбумин. Если ни один из этих агентов не подходит, можно использовать реагенты, не содержащие протеин или блокирующие белок неживотного происхождения, такие как AdvanBlock. В качестве альтернативы в качестве блокирующего реагента можно использовать нормальную сыворотку того же вида, что и животное, у которого было продуцировано первичное антитело.

Недостаточная промывка

Важно тщательно промыть блот после инкубации с первичными и вторичными антителами, чтобы удалить избыточные антитела.Плохая стирка может способствовать высокому однородному фону.

Изменение объема, длины и количества промывок

Выполняйте промывки в большом объеме, часто меняйте промывочный раствор и встряхивайте мембрану во время этапов промывки. Рекомендуемый протокол - промывать мембрану 3 раза после каждой инкубации, промывая в течение 5 минут на каждую промывку. Количество стирок и продолжительность стирки можно увеличить для повышения эффективности стирки; однако чрезмерная промывка может снизить мощность сигнала.

Повышение строгости стирки с моющим средством

Строгость этапа стирки можно повысить, включив моющее средство в промывочный раствор, чтобы нарушить неспецифические взаимодействия.Твин-20 (0,05%) обычно используется в промывочных буферах. Для повышения жесткости стирки можно использовать немного более сильное моющее средство, такое как 0,05% NP-40. Примечание. Следует использовать только высокоочищенные моющие средства, поскольку примеси в моющих средствах могут мешать работе систем обнаружения пероксидазы хрена. В моющие растворы следует добавлять свежее моющее средство, так как моющие средства могут способствовать росту бактерий и вызывать высокий фон (см. Бактериальное заражение).

Мембрана

Различные типы мембран (нитроцеллюлоза по сравнению с ПВДФ), а также производители и / или партии источников мембран могут влиять на уровень фона.Возраст мембраны и то, как с мембранами обращаются, также могут влиять на степень полученного фона.

Типы мембран

Выбор мембраны следует определять эмпирически для каждой комбинации антиген: антитело. Мембраны из нитроцеллюлозы, как правило, дают самый низкий фон, однако они хрупкие, не могут быть удалены и повторно зондированы, и многие из них не связывают более мелкие белки. Мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) обладают высокой связывающей способностью, но могут давать более высокий фон.

Работа с мембраной

Мембраны из ПВДФ требуют активации в метаноле и уравновешивания в воде перед использованием. Если эти шаги пропущены или выполнены неправильно, будет виден высокий однородный фон. Обратитесь к инструкциям производителя для протокола.

Мембраны никогда не должны высыхать, так как это также приведет к высокому однородному фону.

Использование предварительно нарезанных мембран, таких как предварительно нарезанные ПВДФ или нитроцеллюлозные мембраны, продаваемые Advansta, может свести к минимуму обращение с грязными ножницами и контакт с ними.

Источник мембраны

Фоновые уровни также могут варьироваться в зависимости от поставщика мембран. Если виден высокий фон, можно попробовать другой источник для уменьшения фона.

Возраст мембраны

Старые мембраны могут давать высокий однородный фон, поэтому обращайте внимание на сроки годности и используйте новые мембраны для уменьшения фона.

Бактериальное заражение

Бактериальное заражение буферов может привести к высокому фону.

Буферы, содержащие детергент и молоко, которые могут способствовать росту бактерий, должны быть свежими.

Передержка мембраны

Длительная выдержка увеличивает общий фон без увеличения чувствительности.

Можно попробовать несколько вариантов уменьшения времени выдержки. Если возможно, загрузите больше белка, чтобы увеличить количество целевого антигена. Убедитесь, что первичные антитела хорошо титрованы. Если возможно, попробуйте другие первичные антитела. В качестве альтернативы можно использовать реагент для обнаружения, разработанный для белков с низким содержанием, таких как субстрат Advansta WesternBright Quantum HRP.

Пятнистый, неровный или пятнистый фон

В дополнение к высокому однородному фону, фон Вестерн-блоттинга может включать неровный пятнистый фон, случайные черные пятна, белые пятна или очищенные области, неровные полосы и случайные пятнышки. У такого фона есть несколько причин.

Dirt

Хемилюминесцентные реагенты притягиваются к пыли и грязи, которые могут попасть на блот во время промывки или попасть на блот из грязного оборудования. Фон из пыли и грязи обычно выглядит как случайные крапинки на кляксе.

Start без грязи

Чтобы предотвратить загрязнение пылью и грязью, вымойте все оборудование, которое соприкасается с мембраной, включая устройство для переноса и лотки, используемые для инкубации. Отфильтруйте все буферы и растворы, чтобы удалить частицы. Держите посуду крышками, чтобы пыль не попадала в растворы во время инкубации.

Воздушные пузырьки

Если пузырьки воздуха находятся на мембране во время переноса, они будут препятствовать прилипанию белков к мембране. Если пузырьки прикрепятся к мембране позже, они могут помешать блокирующему раствору или антителам получить доступ к мембране.Пузырьки воздуха могут вызвать появление пятен, белых кругов или очищенных участков, а также неполных полос.

Пузырьки воздуха во время установки переноса

Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха при установке переноса, осторожно оберните пипеткой каждую часть в стопке «сэндвич» (мембрана, фильтровальная бумага, губка для переноса) после того, как она будет установлена .

Пузырьки воздуха во время переноса и инкубации

Воздух создается в буфере для переноса из-за смешивания метанола с водным буфером.По возможности приготовьте буфер для переноса за 1-2 дня. Если необходимо использовать свежий буфер, дегазируйте буфер фильтрацией, вакуумом или обработкой ультразвуком. Кроме того, используйте более низкое напряжение для предотвращения образования пузырей.

Избегайте слишком интенсивного перемешивания блоттинга во время инкубации и образования пузырей.

Плохое обращение с мембраной

Пятна, линии и темные пятна часто возникают из-за неправильного обращения с мембраной.

Манипуляции с мембранами

Всегда беритесь с мембранами руками в перчатках и используйте щипцы для манипуляций.Масло на руке приведет к появлению темных пятен. Будьте осторожны, чтобы мембрана не складывалась, это приведет к темным линиям. Не царапайте мембрану при добавлении растворов или использовании пинцета. Убедитесь, что мембрана пропитана растворами во время инкубации, чтобы предотвратить высыхание участков.

Активация и уравновешивание PVDF

При использовании PVDF важно активировать мембрану, а затем уравновесить мембрану в водном растворе, как описано выше. Когда метанол вступает в реакцию с водными растворами, образуются пузырьки воздуха, которые могут прилипать к мембране и препятствовать уравновешиванию и диффузии, создавая пятнистый фон.Убедитесь, что мембрана уравновешена в соответствии с инструкциями производителя. Если существует разница температур между растворами (т.е. вода холодная, а метанол имеет комнатную температуру), то метанол может не вытесняться должным образом; поэтому старайтесь поддерживать равномерную температуру при изготовлении мембраны.

Недостаточное перемешивание компонентов буфера

Компоненты буфера, такие как детергенты и блокирующие агенты, могут прилипать к мембране и вызывать темные пятна, если они не полностью растворены.Это особенно характерно для обезжиренного сухого молока.

Полностью перемешайте компоненты буфера

Перед использованием убедитесь, что все растворы тщательно перемешаны; блокирующие растворы можно перемешивать. Растворы также можно профильтровать перед использованием.

Антитело неравномерно распределяется во время инкубации

Неравномерный пятнистый фон или неполные полосы могут возникать, если антитело неравномерно распределено по мембране во время инкубации.

Держите мембрану покрытой растворами

Используйте достаточно раствора антител, чтобы полностью покрыть мембрану.Во время инкубации встряхивайте блот на шейкере.

Избыточное количество реагентов для обнаружения на блоте

Если реагенты для обнаружения собираются на мембране неравномерно, это может привести к образованию пятен на фоне.

Удалите излишки реагентов обнаружения

Для удаления избытка реагентов обнаружения осторожно промокните белковую сторону мембраны салфеткой Kim-wipe или быстро опустите мембрану на фильтровальную бумагу, чтобы удалить жидкость. Перед экспонированием оберните мембрану полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.

См. Раздел «Несколько диапазонов» для устранения неполадок вестерн-блотов с несколькими дискретными диапазонами. Также см. Наш блог, чтобы узнать о быстром протоколе вестерн-блоттинга.

Фото любезно предоставлено Агнес Периапс.

Зачистка и репробирование вестерн-блотов | Thermo Fisher Scientific

Зачистка и повторное зондирование вестерн-блоттинга - это метод, при котором первичные и вторичные антитела удаляются из вестерн-блоттинга, чтобы можно было повторно зондировать блот.Блот может быть очищен и повторно зондирован несколько раз для визуализации других белков или для оптимизации обнаружения белка (то есть концентрации антител) без необходимости в нескольких гелях и переносах.

Обзор: Удаление буферов Протоколы очистки и повторного зондирования


Зачем раздевать и перепроверять?

Отношение сигнал / шум (отношение сигнал / шум) относится к тому, сколько релевантного контента (сигнала) что-то имеет по сравнению с нерелевантным контентом (шумом).При вестерн-блоттинге сигналом является плотность исследуемой полосы конкретного белка; шум - это плотность фона. Оптимизация отношения сигнал / шум часто более важна, чем повышение чувствительности системы. Чувствительность системы не имеет значения, если сигнал невозможно отличить от шума. При необходимости оптимизация вестерн-блоттинга занимает много времени и может исчерпать ценные образцы. Повторное зондирование вестерн-блоттинга экономит время и образец, позволяя при необходимости выполнять оптимизацию.Повторное зондирование также позволяет зондировать один и тот же блот на предмет различных белков-мишеней.

Преимущества репробирования клякс

Есть несколько основных причин, по которым исследователи решают провести зачистку и повторное зондирование вестерн-блоттинга. Вот некоторые из наиболее важных:

Образцы консервов Если белковая смесь является редкой или ценной, повторное зондирование сохраняет образец и позволяет анализировать мембрану с использованием тех же или разных антител.
Экономит время Запуск SDS-полиакриламидного геля с последующим переносом белков на мембрану занимает много времени. Используя один и тот же блот для нескольких различных обнаружений, вы экономите время.
Экономия денег Повторное использование одного и того же блоттинга позволяет сэкономить деньги на геле, мембране и образце белка.
Более простая оптимизация анализа Интенсивность светового излучения высокочувствительных хемилюминесцентных субстратов часто требует оптимизации концентрации антител для достижения наивысшего качества блоттинга.Оптимизация легко достигается за счет удаления мембраны и повторного зондирования с другой концентрацией антител.
Быстрое подтверждение нетипичных результатов Если результаты иммуноблота не соответствуют ожиданиям, повторное зондирование позволяет использовать тот же образец белка без повторного гель-электрофореза.
Исправьте ошибки Иммуноблоттинг требует много шагов, что дает широкие возможности для ошибок.Удалив мембрану, блот можно использовать повторно.

Пример Вестерн-блоттинга.Лизаты опухолевых клеток HeLa зондировали антителами к актину и детектировали с помощью субстрата для вестерн-блоттинга Thermo Scientific Pierce ECL. Затем блоты очищали с помощью буфера для удаления вестерн-блоттинга Thermo Scientific Restore PLUS. Затем блот повторно блокировали и повторно зондировали антителом к ​​циклохилину B и детектировали с помощью субстрата Pierce ECL.

Как удалить и повторно зондировать мембраны вестерн-блоттинга

Ключом к удалению мембраны является использование условий, которые вызывают высвобождение антитела из антигена, не вызывая высвобождения значительного количества антигена (белка) из мембраны.Для достижения этой цели были разработаны различные протоколы, и они обычно включают некоторую комбинацию детергента, восстанавливающего агента, нагревания и / или низкого pH. Во время процедуры удаления некоторое количество антигена неизбежно теряется из мембраны. Важно минимизировать эту потерю, удаляя антитело в мягких условиях. Поскольку каждая пара антитело-антиген имеет уникальные характеристики, не существует гарантированного метода удаления всех антител при сохранении антигена.

На что следует обратить внимание перед тем, как приступить к очистке мембран, подлежащих повторному зондированию:

Мембраны из ПВДФ
Используйте мембраны из ПВДФ обладают способностью связывать белок 170–200 мкг / см 2 и обеспечивают лучшее удерживание адсорбированных белков, чем другие носители, из-за большей гидрофобности.PVDF менее хрупок и хрупок, чем нитроцеллюлоза, что делает его более полезным при необходимости многократной обработки (процедуры зачистки и повторного зондирования).
Только зачистка и повторное зондирование хемилюминесцентный и флуоресцентный вестерн-блоттинг Колориметрические / хромогенные реагенты для обнаружения оставляют стойкое видимое пятно на мембране, которое не удаляется процедурами зачистки.
Начать с мягких условий Начните с мягких, мягких условий, чтобы избежать потери образца.При необходимости используйте более строгие условия для разрыва сильных пар антиген-антитело.
Первый зонд для белков с низким содержанием При каждом раунде стриппинга существует вероятность потери антигена. Сведите к минимуму эти эффекты, сначала исследуя белки с низким содержанием или с помощью антител с низким сродством.
Избегайте зондов, конъюгированных с авидином Связь между стрептавидином и биотином очень прочная, и ее трудно разъединить для повторного зондирования.

Мягкое удаление мембран вестерн-блоттинга

Рецепт мягкого очищающего буфера
От
Глицин 15 г
SDS 1 г
Твин 20 10 мл
Деионизированная вода 800 мл
pH до 2.2 с HCl
Деионизированная вода до 1000 мл
Протокол мягкой зачистки (зачистка при низком pH)
  1. Промойте мембрану водой, чтобы удалить излишки хемилюминесцентного субстрата на мембране.
  1. Инкубируйте мембрану белковой стороной вверх в стрип-буфере при перемешивании в течение 10-20 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что объем очищающего буфера достаточен, чтобы полностью покрыть мембрану.

Оптимизация времени инкубации и температуры важна для достижения наилучших результатов. Для некоторых антител достаточно инкубации при комнатной температуре. Однако для высокоаффинных антител или насыщенных блотов (избыток вторичных антител) может потребоваться инкубация в течение дополнительных 5–10 минут при 37 ° C.

  1. Промойте мембрану 3 раза при перемешивании по 5 минут каждый в промывочном буфере (TBST или PBST).
  1. Рекомендуется: выполните повторную блокировку мембраны перед повторным зондированием.

Строгая очистка мембран вестерн-блоттинга

Рецепт строгого очищающего буфера
0.5 М трис-HCl, pH 6,8 12,5 мл
10% SDS 20 мл
2-меркаптоэтанол 0,8 мл
Деионизированная вода 67,5 мл
Сделайте буфер непосредственно перед использованием в вытяжном шкафу
Строгий протокол очистки (очистка с помощью тепла и моющего средства)
  1. Промойте мембрану водой, чтобы удалить излишки хемилюминесцентного субстрата на мембране.
  2. Инкубируйте мембрану белковой стороной вверх в удаляющем буфере при осторожном перемешивании в течение 30 минут при 50 ° C в вытяжном шкафу. Убедитесь, что объем очищающего буфера достаточен, чтобы полностью покрыть мембрану.
  3. Промойте мембрану 6 раз при перемешивании по 5 минут каждый в промывочном буфере (TBST).
  4. Выполните повторную блокировку мембраны перед повторным зондированием.

Тестирование и повторное зондирование очищенных клякс

После любой процедуры очистки блот должен быть протестирован, чтобы убедиться, что все реагенты обнаружения были удалены.Мембрану необходимо несколько раз промыть, заблокировать, инкубировать со вторичным антителом, а затем повторно инкубировать с хемилюминесцентным субстратом. Если первичное антитело было эффективно удалено с помощью процедуры стриппинга, вторичное антитело не должно связываться с мембраной и не должно производиться никакого сигнала. Если полосы все еще видны на блоте, условия очистки должны быть усилены. Часто процесс отгонки завершается простым увеличением времени реакции или температуры. Однако иногда необходимо изменить состав буфера очистки или полностью изменить методы.

Вестерн-блоттинг и повторное зондирование. Сравнение стрип-буферов на нитроцеллюлозе. Три различных концентрации лизата клеток HeLa разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану размером 0,45 мкм. (A) После блокирования мембрану анализировали вестерн-блоттингом с использованием субстрата SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate. Мембрану зондировали поликлональным антителом против Hsp90 с последующим введением конъюгата козьей антикроличьей пероксидазы хрена и визуализации. После первоначального обнаружения блот был разрезан на три части и очищен в соответствии с инструкциями производителя либо в буфере для удаления вестерн-блоттинга, либо в растворе для удаления Reblot Plus, либо в буфере для удаления вестерн-блоттинга Revitablot.После процедуры очистки срезы мембран промывали, инкубировали с субстратом и визуализировали. Срезы мембран повторно блокировали и повторяли процедуру вестерн-блоттинга, как описано выше. (B) Денситометрический анализ показывает, что буфер для стриппинга Restore позволял как полное удаление сигнала, так и поддерживал почти идентичные уровни обнаружения между исходным и повторным зондированием вестерн-блот-анализом.

Рекомендуемая литература

Алегрия-Шаффер А, Лодж А, Ваттем К.(2009) Глава 33: Выполнение и оптимизация вестерн-блотов с упором на хемилюминесцентное обнаружение. Методы в энзимологии 463: 573–599.

Дополнительные ресурсы

Обзор вестерн-блоттинга | Thermo Fisher Scientific

Что такое вестерн-блоттинг?

Термин «блоттинг» относится к переносу биологических образцов из геля на мембрану и их последующему обнаружению на поверхности мембраны.Вестерн-блоттинг, или вестерн-блоттинг (также называемый иммуноблоттингом, поскольку антитело используется для специфического обнаружения его антигена), был проведен Towbin и соавт. в 1979 г. и в настоящее время является рутинным методом анализа белков. Специфичность взаимодействия антитело-антиген позволяет идентифицировать целевой белок посреди сложной белковой смеси. Вестерн-блоттинг может дать качественные и полуколичественные данные об интересующем белке.

Поиск продуктов для вестерн-блоттинга Протоколы вестерн-блоттинга Загрузить Справочник по переносу белков

Вступление

Первым шагом в процедуре вестерн-блоттинга является разделение макромолекул в образце с помощью гель-электрофореза.Затем разделенные молекулы переносятся или наносятся на вторую матрицу, как правило, на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (ПВДФ). Затем мембрану блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с поверхностью мембраны. Чаще всего переносимый белок затем исследуют с помощью комбинации антител: одного антитела, специфичного к интересующему белку (первичное антитело), ​​и другого антитела, специфичного к виду хозяина первичного антитела (вторичное антитело).Часто вторичное антитело образует комплекс с ферментом, который в сочетании с подходящим субстратом будет давать детектируемый сигнал. Хромогенные субстраты образуют осадок на мембране, что приводит к видимым глазу колориметрическим изменениям. В наиболее чувствительных методах обнаружения используется хемилюминесцентный субстрат, который производит свет как побочный продукт реакции с ферментом, конъюгированным с антителом. Световой поток можно уловить с помощью пленки. Однако приборы для получения цифровых изображений, основанные на камерах с зарядовой связью (ПЗС), становятся популярной альтернативой пленке для захвата хемилюминесцентного сигнала.В качестве альтернативы можно использовать флуоресцентно меченые антитела, которые требуют обнаружения с использованием прибора, способного улавливать флуоресцентный сигнал. Флуоресцентный блоттинг - это новый метод, популярность которого растет, поскольку он дает возможность мультиплексирования (обнаружение нескольких белков на одном блоте). Какая бы система ни использовалась, интенсивность сигнала должна коррелировать с содержанием антигена на мембране.

Процедуры стадии детекции вестерн-блоттинга сильно различаются.Один из распространенных вариантов включает прямое и косвенное обнаружение. При прямом методе обнаружения первичное антитело, конъюгированное с ферментом или флуорофором, используется для обнаружения интересующего антигена на блоте. Этот метод обнаружения не получил широкого распространения, поскольку большинство исследователей предпочитают косвенный метод обнаружения по разным причинам. В методе непрямого обнаружения сначала используют немеченое первичное антитело для связывания с антигеном. Затем первичное антитело выявляют с помощью вторичного антитела, конъюгированного с ферментом или флуорофором.Этикетки (или конъюгированные молекулы) могут включать биотин, флуоресцентные зонды, такие как флуофоры Invitrogen Alexa Flour или DyLight, и ферментные конъюгаты, такие как пероксидаза хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (AP). Косвенный метод имеет много преимуществ по сравнению с прямым методом, которые описаны ниже.

Прямой метод Косвенный метод
Преимущества
  • Требуется только одно антитело
  • Устраняет проблемы с перекрестной реактивностью вторичных антител
Недостатки
  • Этикетка может мешать связыванию цели
  • Возможен высокий фон, если специфичность антител к мишени слабая
  • Конъюгированные первичные антитела могут быть дорогостоящими
  • Выбор конъюгированных первичных антител может быть ограничен
Преимущества
  • Усиление сигнала вторичным антителом
  • Обширный выбор конъюгированных вторичных антител
  • Одно вторичное антитело можно использовать с рядом различных первичных антител
  • Использование вторичных антител не подавляет связывание первичных антител с мишенями
  • Использование меченых вторичных антител позволяет использовать несколько методов обнаружения
Недостатки
  • Неспецифическое окрашивание может усилить фон
  • При использовании косвенного метода требуются дополнительные действия

Посмотреть видеоролики вестерн-блоттинга

Электрофоретическое разделение белков

Гель-электрофорез - это метод, при котором заряженные молекулы, такие как белок или ДНК, разделяются в соответствии с физическими свойствами, поскольку они проталкиваются через гель электрическим током.Белки обычно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) для характеристики отдельных белков в сложном образце или для исследования нескольких белков в одном образце. В сочетании с вестерн-блоттингом PAGE представляет собой мощный аналитический инструмент, предоставляющий информацию о массе, заряде, чистоте или присутствии белка. Существует несколько форм PAGE, которые могут предлагать различные типы информации об интересующих белках. Например, неденатурирующий PAGE или нативный PAGE разделяет белки в соответствии с их отношениями массового заряда.Напротив, додецилсульфат-ПААГ или SDS-PAGE разделяет белки по массе из-за отрицательного заряда, передаваемого белкам, связанным с ионным детергентом SDS.

Для электрофореза в протеиновом геле доступно несколько буферных систем или химического состава гелей. Каждая система обеспечивает уникальные преимущества при разделении белков с разной молекулярной массой.

Читать далее: Обзор электрофореза белков
Изучить: продукты для электрофореза белков в геле

Перенос белков на мембрану

После электрофореза белок должен быть перенесен из геля на мембрану.Существует множество методов, которые использовались для этого процесса, которые включают, помимо прочего, диффузионный перенос, капиллярный перенос, перенос с помощью вакуумного блоттинга и электроэлюцию. Метод переноса, который чаще всего используется для белков, - это электроэлюция или электрофоретический перенос из-за его скорости и эффективности переноса. Этот метод использует электрофоретическую подвижность белков для переноса их из геля на мембрану. Электрофоретический перенос белков включает помещение содержащего белок полиакриламидного геля в непосредственный контакт с кусочком нитроцеллюлозы или другой подходящей связывающей белок подложки и «прослоение» его между двумя электродами, погруженными в проводящий раствор.Процесс включает использование пористых подушек и фильтровальной бумаги для облегчения переноса. При приложении электрического поля белки выходят из полиакриламидного геля на поверхность мембраны, где они плотно прикрепляются. В результате получается мембрана с копией белкового рисунка, который изначально был в полиакриламидном геле.

Аппарат для переноса вестерн-блоттинга. Схема, показывающая сборку типичного устройства вестерн-блоттинга с положением геля, переносящей мембраной и направлением белка по отношению к положению электрода. Хотя изображенное здесь изображение представляет собой вертикальное устройство для «влажного» переноса, ориентация применима для горизонтально расположенного устройства для полусухого переноса.

Эффективность переноса может сильно различаться между белками в зависимости от способности белка мигрировать из геля и его склонности связываться с мембраной при определенных условиях.Эффективность переноса зависит от таких факторов, как состав геля, полный контакт геля с мембраной, положение электродов, время переноса, размер и состав белков, напряженность поля и присутствие детергентов и спирта в буфер.

После переноса и перед проведением вестерн-блоттинга общий белок на мембране можно оценить с помощью белкового окрашивания для проверки эффективности переноса. Гель также можно окрашивать, чтобы подтвердить, что белок вышел из геля, но это не гарантирует эффективного связывания белка с мембраной.Поскольку красители могут мешать связыванию и обнаружению антител, легко удаляемое белковое пятно является идеальным. Окрашивание Ponceau S - наиболее широко используемый реагент для обратимого окрашивания белков на мембране, хотя он имеет ограниченную чувствительность, плохо фотографирует и может быстро выцветать, что затрудняет документирование. Доступны превосходные альтернативы окрашиванию белка на мембранах из нитроцеллюлозы или PVDF, которые позволяют обнаруживать низкие уровни белка в нанограммах, легко фотографируются и не выцветают до тех пор, пока не будут удалены.

Сравнение обратимого белкового окрашивания с окрашиванием Ponceau S. Предварительно окрашенный маркер MW наносили на каждый гель (дорожка 1), и неокрашенные маркеры молекулярной массы белка последовательно разбавляли и наносили на каждый 4-20% полиакриламидный гель трис-глицин-SDS (дорожки 2–10).Электроэлюцию использовали для переноса белков на мембраны из ПВДФ. Обратимое краситель Thermo Scientific Pierce наносили на 1 минуту в соответствии с протоколом (панель A). Блот окрашивали 0,1% Ponceau S в 5% уксусной кислоте в течение 5 минут в соответствии с протоколом (панель B).

Электротрансферные системы

Существует несколько стратегий электропереноса.Наиболее распространенными методами являются влажный, полусухой и сухой, каждый из которых требует особых соображений в отношении времени, стоимости и требуемых реагентов и оборудования. Мокрый перенос (также называемый переносом в резервуар) предлагает высокую эффективность переноса, гибкость в буферной системе и выборе методов, но требует затрат времени и усилий. Полусухой блоттинг обеспечивает удобство и экономию времени благодаря гибкости использования нескольких типов буферных систем. Однако полусухой блоттинг может иметь более низкую эффективность переноса белков с большой молекулярной массой (> 300 кДа).Сухой перенос обеспечивает высокое качество и скорость передачи, а также удобство, поскольку буферы не требуются, но имеют ограниченную гибкость в расходных материалах.

Продолжить чтение: Методы переноса вестерн-блоттинга
Изучение: Системы переноса

Блокировка неспецифических сайтов

Мембранные подложки, используемые при вестерн-блоттинге, обладают высоким сродством к белкам.Следовательно, после переноса белков из геля важно заблокировать оставшуюся поверхность мембраны, чтобы предотвратить неспецифическое связывание детектирующих антител на последующих этапах. Для блокирования свободных участков на мембране использовались различные блокирующие буферы, от молока или нормальной сыворотки до высокоочищенных белков. Блокирующий буфер должен повысить чувствительность анализа за счет уменьшения фоновых помех и улучшения отношения сигнал / шум. Ни один блокирующий агент не является идеальным для каждого эксперимента, поскольку каждая пара антитело-антиген имеет уникальные характеристики.Эмпирическое тестирование блокирующих буферов необходимо для оптимизации эксперимента вестерн-блоттинга. Часто блокирующие буферы изготавливаются исследователями в лаборатории; однако коммерчески доступные блокирующие буферы предлагают удобство.

Сравнение блокирующего буфера SuperBlock и молока.Двукратные серийные разведения лизата клеток HeLa (20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 и 0,3125 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозу (панели A – C) или PVDF (панели D – E). мембраны. Мембраны блокировали в течение 1 часа 5% обезжиренного молока в трис-буферном солевом растворе и 0,05% детергента Thermo Scientific Tween 20 или блокирующего буфера Thermo Scientific SuperBlock в фосфатно-солевом буфере с 0,05% детергентом Tween 20. Блоты обрабатывали в течение 5 минут с использованием хемилюминесцентного субстрата Thermo Scientific SuperSignal West Pico (кат.№ 34580) и экспонировали на пленку. Результаты показывают, что блокирующий буфер SuperBlock превосходит молоко для обнаружения целевых белков.

Продолжить чтение: Блокирующие буферы для вестерн-блоттинга и ELISA
Обзор: Блокирующие буферы

Составы промывочного буфера

Как и другие процедуры иммуноанализа, вестерн-блоттинг состоит из серии инкубаций с различными иммунохимическими реагентами, разделенных стадиями промывки.Этапы промывки необходимы для удаления несвязавшихся реагентов и уменьшения фона, тем самым увеличивая отношение сигнал / шум. Недостаточная промывка может привести к высокому фону, в то время как чрезмерная промывка может привести к снижению чувствительности, вызванной элюированием антитела и / или антигена из блота. Как и на других этапах вестерн-блоттинга, могут использоваться различные буферы.

Трис-буферный солевой раствор (TBS) и фосфатно-солевой буфер (PBS) являются наиболее часто используемыми промывочными буферами. В большинстве случаев решения PBS и TBS могут быть взаимозаменяемыми.Однако бывают ситуации, когда использовать одно вместо другого. Например, TBS следует использовать при использовании систем с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (AP), или при обнаружении фосфорилированных белков с помощью фосфоспецифических антител.

Иногда составы промывочного буфера состоят из детергента, такого как 0,05% твин 20, для помощи в удалении неспецифически связанного материала. В зависимости от специфики анализа количество детергента в промывочном буфере будет варьироваться, хотя типичные концентрации составляют от 0.От 05 до 0,5% для моющих средств, таких как Твин 20. Другой распространенный метод - это добавление блокирующего раствора в промывочном буфере в соотношении 1:10. Включение блокирующего агента с детергентом может помочь минимизировать фон в анализе, предотвращая элюцию блокирующего белка с мембраны и / или позволяя происходить неспецифическим взаимодействиям с белком в растворе, а не с иммобилизованными на мембране.

Важно отметить, что моющие средства, как и белковые растворы, могут способствовать росту микробов.Хотя удобно готовить предварительно разбавленные запасы моющих средств, таких как NP-40, CHAPS и Tween 20, в этих растворах могут расти грибки, что может привести к высокому фоновому шуму. Кроме того, моющие средства могут содержать значительное количество пероксидов, которые будут вызывать фоновый сигнал при использовании субстратов пероксидазы хрена. Поэтому важно использовать моющие средства высокой чистоты.

ТБС ПБС TBST ПБСТ
Состав
  • 25 мм Трис
  • 0.15 М NaCl
  • pH 7,2
  • 10 мМ фосфат натрия
  • 0,15 М NaCl
  • pH 7,5
  • 25 мм Трис
  • 0,15 М NaCl
  • 0,05% Твин-20
  • pH 7,5
  • 10 мМ фосфат натрия
  • 0,15 М NaCl
  • 0,05% Твин-20
  • pH 7.5

Первичные и вторичные антитела

Вестерн-блоттинг обычно выполняется путем зондирования заблокированной мембраны первичным антителом, которое распознает определенный белок или эпитоп в группе белков (например,g., домен Sh3 или фосфорилированный тирозин). Выбор первичного антитела для вестерн-блоттинга будет зависеть от детектируемого антигена и от того, какие антитела доступны к этому антигену. Также важно отметить, что не все первичные антитела подходят для вестерн-блоттинга, и, если возможно, следует проверить применение перед покупкой нового первичного антитела.

Как правило, первичное антитело, которое распознает целевой белок при вестерн-блоттинге, не поддается прямому обнаружению.Поэтому помеченные вторичные антитела используются как средство окончательного обнаружения антигена-мишени (непрямое обнаружение). Для вестерн-блоттинга можно использовать широкий спектр меченых вторичных антител. Выбор вторичного антитела зависит либо от вида животного, у которого было индуцировано первичное антитело (вид хозяина), либо от любой метки, связанной с первичным антителом (например, биотина, гистидина (His), гемагглютинина (HA) и т. Д.) Например, если первичное антитело представляет собой немодифицированное мышиное моноклональное антитело, то вторичное антитело должно быть вторичным антителом против IgG мыши (или не-IgG), полученным от не-мышиного хозяина.

Антитела для вестерн-блоттинга обычно используются в виде разбавленных растворов, и производители могут рекомендовать использовать диапазоны разведения от 1 / 100–1 / 500 000 от исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл. Однако оптимальное разведение данного антитела с помощью конкретной системы обнаружения необходимо определять экспериментально. Более чувствительные системы обнаружения требуют меньше антител, чем системы с более низкой чувствительностью, и могут привести к существенной экономии затрат на антитела и позволяют растянуть ограниченное количество антител на большее количество экспериментов.Использование меньших количеств антитела также может иметь дополнительное преимущество в виде снижения фона, поскольку ограниченное количество антитела показывает повышенную специфичность в отношении мишени с наивысшим сродством.

Разведения антител обычно проводят в промывочном буфере. Присутствие детергента и небольшого количества блокирующего агента в разбавителе антител часто помогает минимизировать фон, тем самым увеличивая отношение сигнал / шум. И наоборот, добавление слишком большого количества блокирующего агента или детергента к раствору для разведения антител может препятствовать эффективному связыванию антитела с антигеном, вызывая снижение сигнала, а также снижение фона.

Продолжить чтение: Вторичные антитела как зонды
Изучение: антитела вестерн-блоттинга

Методы обнаружения

Хотя существует множество различных меток, которые можно конъюгировать со вторичным или первичным антителом, используемый метод обнаружения ограничивает выбор того, что можно использовать в анализе вестерн-блоттинга.Радиоизотопы широко использовались в прошлом, но они дороги, имеют короткий срок хранения, не дают улучшения отношения сигнал / шум и требуют специального обращения и утилизации. Альтернативные метки - ферменты и флуорофоры.

Ферментные метки чаще всего используются для вестерн-блоттинга и, хотя они требуют дополнительных действий, могут быть чрезвычайно чувствительными при оптимизации с подходящим субстратом. Пероксидаза хрена (HRP) и, в меньшей степени, щелочная фосфатаза (AP) являются двумя ферментами, наиболее широко используемыми в качестве меток для обнаружения белков.Для использования с любым ферментом доступен ряд хромогенных, флуорогенных и хемилюминесцентных субстратов. Щелочная фосфатаза имеет явное преимущество перед другими ферментами в том, что скорость ее реакции остается линейной, улучшая чувствительность, просто позволяя реакции протекать в течение более длительного периода времени. К сожалению, увеличенное время реакции часто приводит к высокому фоновому сигналу, что приводит к низкому отношению сигнал / шум. Антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, считаются превосходящими конъюгаты антитело-AP в отношении специфической активности как фермента, так и антитела из-за меньшего размера фермента HRP и совместимости с реакциями конъюгации.Кроме того, высокая активность, хорошая стабильность, низкая стоимость и широкая доступность субстратов делают HRP предпочтительным ферментом для большинства приложений.

Конъюгированные с ферментом антитела предлагают максимальную гибкость в методах обнаружения и документирования вестерн-блоттинга из-за разнообразия доступных субстратов. Самая простая система обнаружения / документирования - использовать хромогенные субстраты. Хотя хромогенные субстраты не так чувствительны, как другие субстраты, они позволяют непосредственно визуализировать развитие сигнала.К сожалению, хромогенные субстраты имеют тенденцию блекнуть по мере высыхания блота или во время хранения, что делает сам блот ненадежным средством документации. Однако довольно просто сделать фотокопию или сканировать блот напрямую, чтобы получить постоянную копию результатов хромогенного вестерн-блоттинга.

Хемилюминесцентные субстраты для блоттинга отличаются от других субстратов тем, что сигнал является временным продуктом фермент-субстратной реакции и сохраняется только до тех пор, пока происходит реакция.Если либо субстрат израсходован, либо фермент теряет активность, реакция прекращается и сигнал теряется. Однако в хорошо оптимизированных анализах с использованием надлежащих разведений антител и достаточного количества субстрата реакция может давать стабильный световой поток в течение от 1 до 24 часов в зависимости от субстрата, что обеспечивает последовательное и чувствительное обнаружение, которое может быть задокументировано с помощью рентгеновской пленки или цифрового изображения. оборудование. В то время как рентгеновская пленка может использоваться для получения полуколичественных данных, цифровая визуализация более чувствительна из-за широкого динамического диапазона обнаружения, что позволяет исследователям получать количественные данные с помощью вестерн-блоттинга.

Использование антител, конъюгированных с флуорофором, требует меньшего количества шагов, поскольку в анализе нет стадии разработки субстрата. Хотя протокол короче, этот метод требует специального оборудования для обнаружения и документирования флуоресцентного сигнала из-за необходимости в источнике возбуждающего света. Последние достижения в области цифровой визуализации и разработка флуорофоров нового поколения, таких как инфракрасные, ближние инфракрасные и квантовые точки, повысили чувствительность и популярность использования флуоресцентных зондов для вестерн-блоттинга и других иммуноанализов.Хотя оборудование и антитела, конъюгированные с флуорофором, могут быть довольно дорогими, этот метод имеет дополнительное преимущество мультиплексной совместимости (использование более одного флуорофора в одном эксперименте). Кроме того, количество химических отходов сокращается по сравнению с другими процедурами блоттинга.

Читать дальше: Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг
Изучить: Реагенты для обнаружения
Изучить: Western Blot Imaging Systems


  1. Towbin и др.(1979) Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения. PNAS 76: 4350–4354.
  2. Куриен, Б. и Скофилд Р.Х. (2009) Введение в белковый блоттинг. В: Блоттинг и обнаружение белков: методы и протоколы. Нью-Йорк: Humana Press. С. 9–22.
  3. Куриен, Б. и Скофилд, Р.Х. (2009) Неэлектрофоретический двунаправленный перенос одного геля SDS-PAGE с несколькими антигенами для получения 12 иммуноблотов.В: Блоттинг и обнаружение белков: методы и протоколы. Нью-Йорк: Humana Press. С. 55–65.
  4. Westermeier, R., et al. (2005) Блоттинг. В кн .: Элетрофорез на практике. Руководство по методам и применению разделения ДНК и белков, 4-е изд. Нью-Йорк: Wiley-VCH. С. 67–80.
  5. Peferoen, M. (1988) Вакуумный блоттинг: недорогой, гибкий, качественный метод блоттинга. В: Walker, J.M., Ed., Methods in Molecular Biology - New Protein Techniques. Нью-Йорк: Humana Press. Vol.3. С. 383–393.
  6. Gooderham, K. (1984) Методы переноса при блоттинге белков. В: Walker, J.M., Ed., Methods in Molecular Biology-Proteins. Нью-Йорк: Humana Press. Vol. 1. С. 165–177.
  7. Khyse-Andersen, J. (1984) Электроблоттинг нескольких гелей: простой аппарат без буферного резервуара для быстрого переноса белков из полиакриламида в нитроцеллюлозу. Biochem. Биофиз. Meth. 10: 203.
  8. Тови, Э.Р. и Бальдо, Б.А. (1987) Сравнение полусухого и обычного бак-буферного электропереноса белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные мембраны.Электрофорез 8: 384–387.

Western Blotting Руководство по устранению неполадок | Cell Signaling Technology

Общий фон высокий или неспецифические полосы появляются после непродолжительного воздействия блоттинга на пленку. Помните о том, что антитела по мотивам, посттрансляционные модификации и варианты сплайсинга могут приводить к множественному образованию полос.

Препарат лизата

Свежеприготовленные образцы дают меньше неспецифических полос и полос деградации и, следовательно, дают более чистый блот. Как правило, экстракты тканей, как правило, содержат больше фоновых полос и продуктов разложения, чем экстракты клеточных линий из-за соединительной ткани. Использование свежих, обработанных ультразвуком и очищенных экстрактов тканей может уменьшить фон. Образцы всегда следует лизировать в подходящих буферах, которые включают ингибиторы протеаз и ингибиторы фосфатаз для фосфатаз (коктейль ингибиторов фосфатазы (100X) # 5870, коктейль ингибиторов протеазы / фосфатазы (100X) # 5872, коктейль ингибиторов протеаз # 5871).Мы рекомендуем использовать буфер для лизиса клеток (№ 9803) или буфер RIPA (№ 9806), который содержит более сильный детергент, для подготовки образцов и количественного определения концентрации белка. Загрузочный буфер SDS (# 7722 или # 7723) можно использовать для лизиса целых клеток без количественного определения белка. Буфер экстракта клеток Chaps (# 9852) используется для приготовления фракций цитоплазматических клеток и полезен для изучения передачи сигналов каспазы. Набор для фракционирования клеток (№ 9038) используется для получения фракций цитоплазматических, мембранных / органелл и ядерных / цитоскелетных клеток.

Мембрана

Используйте высококачественную нитроцеллюлозную мембрану (Nitrocellulose Sandwiches № 12369). Обычно рекомендуется размер пор 0,2 мкм; мембраны с размером пор 0,45 мкм не рекомендуются для белков менее 30 кДа. Мембраны из ПВДФ могут давать более высокий фон, чем нитроцеллюлоза. Нейлоновые мембраны не рекомендуются для вестерн-блоттинга. Блокируйте в течение 1 часа при комнатной температуре в 5% обезжиренном сухом молоке в TBST.

Первичное разведение и / или инкубация антител

Инкубируйте первичные антитела в течение ночи при 4 ° C в TBST в рекомендованном разведении с рекомендованным блокирующим агентом (5% BSA или 5% обезжиренного сухого молока).Для индивидуальных антител, пожалуйста, обратитесь к таблице данных продукта для рекомендованного буфера для разведения.

Неправильная стирка

Промывка в течение меньшего времени, чем рекомендуется три раза по 5 минут в TBST, является обычным явлением и может привести к высокому фону. Мы рекомендуем рассчитывать время стирки для обеспечения точности. Кроме того, низкий уровень твина ® 20 может способствовать возникновению высокого фона; мы рекомендуем 0,1% Tween® 20. Это относится к этапам промывки после инкубации как первичных, так и вторичных антител.

Вторичное разведение и / или инкубация антител

Некоторые вторичные антитела неспецифически связываются с белками клеточных экстрактов. Чтобы оценить качество вторичных антител, выполните блоттинг (вплоть до экспонирования пленки) без первичных антител. Серийные разведения вторичных антител могут быть выполнены на блотах с теми же клеточными экстрактами и первичными антителами для оптимизации концентрации вторичных антител. Всегда инкубируйте вторичные антитела в 5% обезжиренном сухом молоке в TBST в течение 1 часа при комнатной температуре, разбавление вторичных антител в BSA дает более высокие уровни фоновых полос.Вторичные антитела CST ™ уже оптимизированы и не требуют титрования.

Реагент обнаружения

Хемилюминесцентное обнаружение требует использования воды высокой чистоты для разбавления концентрированных реагентов. Используйте только очищенную воду без органических и неорганических примесей. Мы рекомендуем использовать воду RODI. Кроме того, убедитесь, что мембрана никогда не высыхает во время процесса инкубации антител до воздействия реагента обнаружения.

Время выдержки

Время экспонирования пленки более 30 секунд приводит к усилению фонового сигнала. Чтобы избежать длительного воздействия, важно использовать клеточные линии или ткани с адекватными уровнями экспрессии белка и использовать рекомендуемые условия инкубации первичных антител (см. Раздел о разведении и / или инкубации первичных антител). При необходимости используйте лечение, чтобы вызвать выражение или изменение.

Интересующий белок не может быть обнаружен после непродолжительного воздействия блоттинга на пленку.

Препарат лизата

20–30 мкг общего белка из экстрактов целых клеток на дорожку обычно достаточно для обнаружения. Если базальные уровни целевого белка или модификации белка низкие, может быть необходимо вызвать экспрессию или модификацию с помощью химического стимулятора. Возможно, вы захотите изучить альтернативные клеточные линии или ткани, в которых больше интересующего белка. Образцы всегда следует лизировать в соответствующих буферах, которые включают ингибиторы протеаз и ингибиторы фосфатаз, для фосфатаз (коктейль ингибиторов фосфатазы (100X) # 5870, коктейль ингибиторов протеазы / фосфатазы (100X) # 5872, коктейль протеаз # 5871).Лизаты всегда следует обрабатывать ультразвуком, чтобы обеспечить эффективную экстракцию белка из хроматина и мембраносвязанных мишеней. Пожалуйста, посетите Таблицу контроля на нашем веб-сайте, чтобы ознакомиться с предлагаемыми положительными контролями и методами лечения.

Первичное разведение и / или инкубация антител

Инкубируйте первичные антитела в течение ночи при 4 ° C в TBST в рекомендованном разведении с рекомендованным блокирующим агентом (5% BSA или 5% обезжиренного сухого молока). Использование альтернативных блокирующих агентов, таких как желатин, сыворотка, безбелковые блокирующие агенты, казеин или смешанные блокирующие агенты, может снизить интенсивность сигнала цели.Для получения оптимальных результатов с отдельными антителами, пожалуйста, обратитесь к таблице данных продукта для рекомендованного буфера для разведения.

SDS-PAGE Выбор геля

Как правило, рекомендуются гели с трис-глицином. Однако для высокомолекулярных белков мы рекомендуем трис-ацетатные гели и соответствующие буферы. Белки переносятся более эффективно из гелей размером 1 мм, чем из гелей 1,5 мм. Использование более толстых гелей может привести к неполному переносу высокомолекулярных белков, поэтому мы рекомендуем контролировать эффективность переноса и вносить изменения в условия переноса, чтобы оптимизировать размер интересующей белковой мишени.

Трансфер и мембрана

Неполный переход можно исправить более длительным переключением или использованием более высокого напряжения. Как правило, мы рекомендуем включать 20% метанола в буфер для переноса и выполнять влажный перенос в течение 2 часов при 70 В. Для белков с высокой молекулярной массой мы рекомендуем уменьшить содержание метанола в буфере для переноса до 5%, чтобы повысить эффективность переноса и избежать фиксации больших объемов. белков в гелевой матрице, а также увеличение времени переноса до 3 часов при 70 В.Избыточный перенос (перенос белка через мембрану) может быть проблематичным при исследовании более мелких белков. Для небольших белков важно использовать мембрану с размером пор 0,2 мкм и влажный перенос в течение 1,5 часов при 70 В, а не мембрану с размером пор 0,45 мкм или перенос в течение ночи, что может привести к избыточному переносу и отсутствию сигнала малого белка.

Блокировка

Слишком долгое блокирование мембраны может скрыть антигенные эпитопы и помешать связыванию антитела.Заблокируйте всего на 1 час при комнатной температуре.

Стирка

Промывка дольше трех раз по 5 мин является распространенной проблемой и может привести к снижению сигнала. Мы рекомендуем рассчитывать время стирки для обеспечения точности. TBST должен содержать 0,1% Tween® 20. Это относится к этапам промывки после инкубации как первичных, так и вторичных антител. Кроме того, мы рекомендуем промывать в TBST, поскольку было показано, что промывание в PBST приводит к снижению сигнала.

Вторичное разведение и / или инкубация антител

Серийные разведения вторичных антител могут быть выполнены на блотах с теми же клеточными экстрактами и первичными антителами для оптимизации концентрации вторичных антител. Всегда инкубируйте вторичные антитела в 5% обезжиренном сухом молоке в TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Избегайте включения азида натрия в буферы вторичных антител, конъюгированных с HRP, поскольку азид ингибирует активность HRP. Вторичные антитела CST ™ уже оптимизированы и не требуют титрования.

Реагент обнаружения

Используйте биотинилированные стандарты молекулярной массы, которые могут быть обнаружены с помощью анти-биотина-HRP, в качестве положительных контролей для хемилюминесцентного обнаружения.

Удаление мембраны вестерн-блоттингом для протокола восстановления

Наш протокол по удалению и восстановлению мембран вестерн-блоттинга включает пошаговые инструкции по удалению антител с мембран вестерн-блоттинга.

Распечатайте этот протокол.

Стриппинг - это термин, используемый для описания удаления первичных и вторичных антител с мембраны вестерн-блоттинга. Стриппинг полезен, когда кто-то хочет исследовать более одного белка на одном и том же блоте, например, интересующий белок и контроль загрузки. При зондировании нескольких целей удаление и повторное зондирование одной мембраны вместо прогона и блоттинга нескольких гелей дает преимущество в экономии образцов, материалов и времени.

Не рекомендуется проводить количественные сравнения мишеней, зондированных до и после стриппинга, поскольку процедура удаляет часть образца белка с мембраны.По той же причине не следует исследовать очищенную мембрану, чтобы продемонстрировать отсутствие белка.



Для минимизации потерь белка в образце настоятельно рекомендуется использовать мембрану из ПВДФ. Также обратите внимание, что колориметрические / хромогенные реагенты для обнаружения будут оставлять постоянное видимое пятно на мембране, которое может помешать последующему обнаружению мишеней с аналогичным молекулярным весом. Рекомендуются хемилюминесцентные реагенты, такие как ECL, поскольку они не оставляют пятен и более чувствительны, чем колориметрические реагенты.



Следующие два протокола различаются по степени жесткости обращения. Как правило, сначала попробуйте более мягкий, а затем переходите к более жесткому, если все еще есть сигнал от антитела, которое пытается удалить. Эти шаги можно повторить для зондирования с несколькими антителами, хотя потенциальный сигнал может быть слабее, а фон выше после каждого раунда стриппинга. Некоторые исследователи сообщают об успешном окрашивании мембраны после удаления десяти или более раз.



Эффективность стриппинга можно проверить, инкубируя мембрану с хемилюминесцентным детектором. Если очистка считается удовлетворительной, промойте мембрану несколько раз буфером, затем заблокируйте перед продолжением инкубации антител.


Решено 7 общих проблем с западным переводом

Цель этого блога - осветить некоторые стандартные проблемы, возникающие при вестерн-блоттинге, и предложить возможные решения. 7 распространенных проблем:

  1. Равномерно высокий фон
  2. Пятнистый или пятнистый фон
  3. Слабый сигнал или нет сигнала
  4. Неспецифические полосы
  5. Диффузные полосы
  6. Призрачные / полые полосы или коричневые / желтые полосы на мембране
  7. Пустые области

1.Равномерное высокий фон

Высокая концентрация антител

Уменьшить концентрацию антител. Высокие концентрации антител приведут к покрытию мембраны антителами из-за насыщения, что приведет к однородному сигналу по всей мембране. Высокая концентрация антител также может привести к развитию неспецифических полос.

Помехи от несовместимого блокирующего агента

Многие блокирующие агенты основаны на белке, а некоторые - на основе сывороточного белка, например, бычьего сывороточного альбумина.Антитела, вырабатываемые у животных, имеют неотъемлемую проблему, заключающуюся в том, что они могут взаимодействовать с животными белками, используемыми в блокирующих средствах. Поскольку блокирующий агент находится на всей поверхности мембраны, будет виден равномерный сигнал. Лучшее решение - найти агенты, не блокирующие животных, такие как G-Biosciences NAP-BLOCKER. Другими альтернативами являются блокаторы, не содержащие белков, или блокаторы белков, не относящихся к млекопитающим.

Некоторые блокирующие агенты могут фактически связываться с интересующим антигеном и, следовательно, предотвращать связывание антител и последующее обнаружение.

Неконкретные сайты недостаточно заблокированы

Оптимизация условий блокировки важна для четкого фона. Факторами, которые необходимо исследовать, являются пробирка с блокатором (см. Выше), продолжительность инкубации и температура инкубации. Включение Твина 20 в конечной концентрации 0,05% также может улучшить блокировку.

Недостаточная стирка

Неправильная промывка приведет к тому, что на блоте останется избыток антител. Увеличьте объем, длину и количество этапов стирки.Для улучшения промывки используйте промывочные буферы с Tween 20.

Передержка мембраны

Простое решение: сократить время воздействия!

Плохое обращение с мембраной

Мембраны плохо гидратированы перед переносом развития вестерн-блоттинга. PVDF требует метанола для надлежащей гидратации. Если во время процедуры мембрана высыхает, может возникнуть высокий фон. Старые мембраны также могут серьезно повлиять на качество ваших блотов

Загрязнение буферов

Наличие бактерий или других загрязняющих веществ серьезно влияет на блоттинг.Заменить старые буферы.

2. Фон с пятнами или крапинками

Конъюгированные ферментные антитела, конъюгированные

Конъюгация вторичного антитела может привести к появлению интенсивных пятен на мембране с пятнистым рисунком. Отфильтровать конъюгат через фильтр 0,2 мкм может решить проблему. Если нет, используйте свежие антитела.

Грязное оборудование

Присутствие загрязнений на грязном оборудовании может привести к образованию пятнистых или пятнистых рисунков. Перед использованием убедитесь, что все оборудование чистое.Небольшие кусочки геля на мембране также могут вызывать этот эффект.

Высокая концентрация антител

Помехи от несовместимого блокирующего агента

Неконкретные сайты недостаточно заблокированы

Недостаточная стирка

Передержка мембраны

Плохое обращение с мембраной

Загрязнение буферов

3. Слабый сигнал или отсутствие сигнала

Неправильный перенос или белок

Плохой перенос белка на мембрану - это обычная проблема, о которой часто забывают.Если нет белка, не будет сигнала. Наличие захваченных пузырьков воздуха предотвратит перенос белка, что приведет к появлению пустых областей на проявленном блоте. После переноса можно выполнить этап быстрого контроля качества для проверки переноса с помощью обратимого красителя, такого как Ponceau-S, или имеющихся в продаже красителей. SWIFT Membrane Stain - это 30-секундное обратимое пятно, которое предлагает более удобные для пользователя свойства по сравнению с Ponceau-S.

Если после проверки мембраны произошел плохой перенос, изучите другие варианты, такие как уникальный продукт от G-Biosciences, который сокращает время переноса, предотвращает перегрев и способствует переносу высокомолекулярного белка.Наши вкладыши для переноса Swift должны помочь.

Использование 20% метанола в буферах для переноса должно улучшить перенос. Для белков с малой молекулярной массой уменьшите время переноса и используйте мембраны с меньшим размером пор.

Причиной может быть низкий уровень антигена на мембране в результате плохого переноса или недостаточной нагрузки на гель. По возможности используйте более высокие уровни антигена.

Концентрации антител

Слишком высокая концентрация антитела может не только вызвать высокий фон, но также может израсходовать весь субстрат до того, как его можно будет обнаружить, что приведет к отсутствию или слабому сигналу.Признаком этого могут быть коричневые / желтые полосы на мембране или призрачные / полые полосы на пленках.

Слишком низкая концентрация также приведет к слабому сигналу или его отсутствию. Убедитесь, что оптимизированы как первичные, так и вторичные антитела.

Ингибирование конъюгированного фермента

Присутствие азида натрия в буферах в качестве консерванта для предотвращения роста бактерий и других загрязняющих веществ может ингибировать HRP и другие ферменты. Это приведет к слабому сигналу или его отсутствию. Избегайте использования азида натрия во время вестерн-блоттинга.

Неактивные подложки для обнаружения

Если субстраты для Вестерн-блоттинга испортились, слабый или сигнал отсутствует. Убедитесь, что субстраты находятся в пределах их срока годности, и убедитесь, что не происходит перекрестного загрязнения во время работы с 2–3-компонентными системами. Субстраты для обнаружения можно быстро протестировать, приготовив их в микроцентрифужной пробирке и добавив небольшое количество фермента, конъюгированного с ферментом. Для хемилюминесцентных реагентов добавляйте в темную комнату, чтобы визуализировать синий свет.

Чрезмерное снятие изоляции

Если мембрана была очищена и подвергнута повторному зондированию, а сигнал слабее, чем ожидалось, то метод удаления может быть слишком жестким и антигенные сайты разрушены.Используйте мягкий раствор для очистки, такой как Western ReProbe, который не требует кипячения, денатурирующих веществ или SDS. Также ограничьте количество удалений кляксы.

Время воздействия на короткое замыкание

Оставьте пленку дольше и убедитесь, что пятно открылось как можно скорее после добавления субстрата.

Помехи от несовместимого блокирующего агента

4. Неспецифические диапазоны

Паспорт безопасности данных, мешающий блоту

Присутствие сильного анионного детергента SDS на мембране или в буферах может привести к развитию неспецифических полос, вызванных связыванием антител с заряженными молекулами SDS, связанными с белками.Убедитесь, что блот тщательно промывают после переноса и не используют SDS во время разработки вестерн-блоттинга.

Высокая концентрация антител

5. Диффузные полосы

Высокая концентрация белка

Высокие концентрации белка могут привести к появлению диффузных полос белка после проявления блоттинга. Уменьшите количество изначально загруженного белка.

Высокая концентрация антител

6. Призрачные / полые полосы или коричневые / желтые полосы на мембране

Концентрации антител

7.Пустые области

Неправильный перенос или белок

.